幽門螺桿菌CagA與YWHAE互作區(qū)段的確定

張曉艷，溫春燕，陳 豪，佘菲菲

胃癌，全球最常見癌癥中排名第5，死亡率位居第4，嚴重威脅著人類健康[1]。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是胃癌發(fā)生的I類致癌原。該菌的細胞毒素相關蛋白(cytotoxin associated antigen A，CagA)，是其最重要的毒素之一，已證實是致癌蛋白，在胃癌發(fā)生發(fā)展的機制研究中備受關注[2-3]。

YWHAE全稱酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白ε肽(Tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein，epsilon)，為14-3-3蛋白家族ε亞型，是生物進化中的保守蛋白。該蛋白能與多種細胞蛋白相互作用，調控細胞信號轉導、凋亡、遷移等過程，在肝癌、腎癌、乳腺癌等腫瘤中高表達，具有促癌作用[4]。但在胃癌研究中，不同團隊報道不一。Leal MF團隊[5-6]發(fā)現，臨床樣本中，YWHAE在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁組織；胃癌細胞中，下調YWHAE可上調細胞周期分裂蛋白CDC25B，并促發(fā)原癌基因MYC的表達，進而誘導細胞增殖、侵襲和遷移。Gong XX團隊[7]報道，在細胞和裸鼠水平，抑制YWHAE表達可抑制胃癌細胞增殖、生長；Yang M團隊[8]報道，YWHAE受到核凋亡誘導因子1(NAIF1)的負調控，在胃癌細胞中呈現高表達。胃癌中，YWHAE抑癌還是促癌，亟待深入探討。

CagA蛋白通?？煞譃镹-末端保守區(qū)(約占70%)和C-末端可變區(qū)(約占30%)。已有研究表明[3]，其N-末端可與RUNX3、ASPP2、β1整合素等互作，促進RUNX3、ASPP2的降解，參與CagA移位和細胞內漿膜面定位等；其C-末端可與CSK、SHP2、c-Met等互作，具有抑制SFK、FAK活性，增強細胞活性等功能；而SHP1、TAK1則與CagA的N-末端與C-末端均分別存在結合，具有介導CagA的酪氨酸去磷酸化，參與激活細胞NF-κB等作用。確定CagA與宿主蛋白互作的結合區(qū)段，是CagA與宿主蛋白相互作用機制研究的重要組成，有助于深入闡明CagA的致癌機制。

本研究團隊，在CagA的致胃癌機制研究中發(fā)現，YWHAE可與CagA互作，并激活胃癌細胞NF-κB的活性[9]，但二者互作的具體機制尚未闡明。因此，本研究擬在酵母細胞、哺乳動物細胞水平，通過酵母雙雜交、免疫共沉淀及雙熒光素酶報告基因檢測等方法，研究與YWHAE互作的CagA區(qū)段，旨在探討CagA與YWHAE互作的機制，以期進一步揭示幽門螺桿菌相關胃癌的發(fā)生發(fā)展機制。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、質粒、病毒和細胞 酵母菌株AH109和Y187(Clontech)。質粒pGBKT7-cagA、pcDNA3.1+cagA-FLAG、pcDNA3.1+cagA-N-FLAG、pcDNA3.1+cagA-M-FLAG、pcDNA3.1+cagA-C-FLAG和pGADT7-YWHAE、pcDNA3.1-myc-YWHAE[我室(消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室)構建并保存][9-10]，pNF-κB-Luc(Clontech)，pRL-TK(Promega)。細胞COS-7和AGS(中科院上海細胞庫)，AGS-siNC和AGS-siYWHAE細胞(我室構建并保存)[11]。

1.2 主要試劑 酵母培養(yǎng)基及相關添加劑(Clontech)，3-AT、ONPG、F12K培養(yǎng)基(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基、胰酶(GIBCO)，胎牛血清(FBS)(PAN)，FuGENE○R6 Transfection Reagent、the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)，Western及IP細胞裂解液(碧云天)，Protein A&G Agarose(Santa cruz)。

1.3 酵母細胞水平檢測CagA與YWHAE互作的區(qū)段

1.3.1 CagA分段蛋白在酵母細胞中的表達鑒定 為檢測與YWHAE互作的CagA區(qū)段，將CagA蛋白分為CagA-N、CagA-M、CagA-(N+M)、CagA-C不同的區(qū)段[12]。以pGBKT7-cagA[9]為模板，PCR擴增分段蛋白基因(所用引物“P1-P6”和目的片段詳情見表1和圖1-A)，將各基因片段分別插入pGBKT7質粒中。按照《Yeast Protocols Handbook》(Clontech)的方法，各重組質粒分別轉化酵母AH109細胞，并進行Western blot檢測：使用Rabbit anti-CagA (b-300) 抗體(針對CagA 1-300氨基酸，1∶200， Santa Cruz)檢測CagA-N、-M和 (N+M)分段蛋白的表達；使用Myc-Tag (9B11) 抗體(1∶1 000，Cell Signaling Technology)檢測CagA-C蛋白的表達(Myc為表達載體的標簽蛋白)。

1.3.2 酵母雙雜交檢測CagA互作區(qū)段 采用“the GAL4 yeast two-hybrid system”進行酵母雙雜交檢測CagA互作區(qū)段。按照《Yeast Protocols Handbook》，為避免因CagA分段蛋白具有反式激活GAL4反應元件的特性而造成酵母雙雜交結果假陽性，首先采用“濾紙法”定性檢測各轉化菌株的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)活性判斷 CagA分段蛋白是否具有該反式激活特性：將CagA分段蛋白及CagA蛋白重組質粒各自轉化的酵母菌株AH109[pGBKT7-cagA]、AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]單克隆，各自劃雙斜線接種于Whatman○R3M濾紙上(濾紙?zhí)崆百N于SD/-Trp平板)，30 ℃培養(yǎng)20 h；將濾紙，于液氮中15 s、室溫30 min，置Z buffer檢測液進行顯色檢測。AH109[pCL1](SD/-Leu平板)為陽性對照， AH109[pGBKT7-lam]與AH109[pGBKT7]為陰性對照。其次，將CagA分段蛋白重組質粒轉化的AH109菌株與酵母Y187[pGADT7-YWHAE]菌株，分別進行酵母一對一交配實驗[9]，簡述即：Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-N]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-M]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]、Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-C]， Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA]和Y187[pGADT7-T]×AH109[pGBKT7-53]均為陽性對照，Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]為陰性對照。最后，挑取上述交配產物的菌落(雜合子克隆)，采用“ONPG液相分析法”定量檢測β-gal活性，判斷與YWHAE互作的CagA區(qū)段，即：每種交配，挑取QDO/X-α-gal/3-AT平板上雜合子克隆各5個，若QDO/X-α-gal/3-AT平板上無克隆，則挑取SD/-Leu/-Trp平板上的雜合子克隆各5個，進行液體培養(yǎng)并定量(檢測OD600值)，然后洗滌、離心濃縮，進而液氮凍融裂解，用Z buffer(含終濃度4 mg/mL的ONPG)進行計時顯色反應，酶標儀檢測(OD420值)，計算各樣品β-gal活性單位[β-galactosidase units=1 000×OD420/(t×0.5×OD600)]，判斷互作情況。

表1 CagA分段蛋白基因PCR擴增引物Tab.1 Details of the PCR primers used for amplification of truncations of the gene encoding CagA

1.4 哺乳動物細胞水平檢測與YWHAE互作的CagA區(qū)段

1.4.1 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測 采用Co-IP檢測與YWHAE互作的CagA區(qū)段，方案參照前期研究[9]：將CagA分段蛋白哺乳動物細胞表達載體(pcDNA3.1+cagA-N-FLAG、pcDNA3.1+cagA-M-FLAG、pcDNA3.1+cagA-C-FLAG，pcDNA3.1+cagA-FLAG為陽性對照，pcDNA3.1+FLAG為空白對照)各自與YWHAE表達載體pcDNA3.1-myc-YWHAE(pcDNA3.1-myc為空白對照)共轉染Cos-7細胞(2×106個/組)，每組DNA總量15 μg(表達載體間等摩爾，并用Herring sperm DNA平衡總量)，轉染試劑(FuGENE○R6 Transfection Reagent)30 μL，按轉染試劑說明書操作。轉染后48 h，收獲細胞，用Western及IP細胞裂解液[含1×PMSF 和Cocktail蛋白酶抑制劑(Roche)]裂解。裂解的可溶性產物，分別先經預清除(1 μg normal IgG和20 μL Protein A&G Agarose)，再進行Co-IP [5 μg anti-FLAG抗體(Sigma)和20 μL Protein A&G Agarose]，最后用標簽抗體anti-FLAG和anti-Myc進行Western Blot檢測。

1.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測分析 為了進一步在哺乳動物細胞水平確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，進行雙熒光素酶報告基因檢測分析[13]CagA候選區(qū)段(N段和C段)與YWHAE互作對細胞NF-κB激活的影響。

上調細胞YWHAE表達水平進行檢測：選用AGS細胞(1.5×105個/組)，用FuGENE○R6 Transfection Reagent，共轉染YWHAE表達載體(0.75 μg)，和CagA-C表達載體(0.25 μg)或CagA-N表達載體(0.75 μg)，以及pNF-κB-luc (0.2 μg，報告質粒)和 pRL-TK (0.02 μg，內參質粒，平衡轉染效率)，并用Herring sperm DNA平衡DNA總量，對照設置參照“Co-IP檢測”。轉染后48 h，收獲細胞，用the Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶活性，并分析。

下調細胞YWHAE表達水平進行檢測：選用AGS-siYWHAE細胞(1.5×105個/組；AGS-siNC細胞為對照)，共轉染CagA-C或CagA-N表達載體(pcDNA3.1+FLAG為對照)，以及pNF-κB-Luc和pRL-TK(各質粒劑量同“上調”方案)。實驗同時設置轉染CagA蛋白(CagA-Full，0.25 μg)表達載體組的平行對照。轉染后48 h，收獲細胞，檢測并分析。

2 結 果

2.1 酵母細胞水平確定與YWHAE互作的CagA區(qū)段

2.1.1 CagA分段蛋白在酵母細胞中表達 成功構建的pGBKT7-cagA-N、pGBKT7-cagA-M、pGBKT7-cagA-(N+M)和pGBKT7-cagA-C重組質粒，分別轉化AH109酵母菌株，經Western Blot檢測，證明CagA分段蛋白基因在AH109中能相應表達(圖1-A和B)。

A: CagA分段模式圖 B: Western Blot檢測圖1 Western Blot檢測CagA分段基因在酵母AH109中的表達Fig.1 Western Blot analysis of fragments of the CagA gene in AH109

2.1.2 酵母雙雜交檢測確定互作的CagA區(qū)段 經濾紙法定性檢測酵母轉化子胞內β-gal活性，AH109[pGBKT7-cagA]、AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]與陰性對照AH109[pGBKT7-lam]和AH109[pGBKT7]在檢測時間內均始終呈無色，證明CagA-N、CagA-M、CagA-(N+M)、CagA-C蛋白與CagA蛋白一樣，不會反式激活GAL4反應元件(圖2 A)，可進行后續(xù)的酵母雙雜交實驗。

A：濾紙法定性檢測：* AH109[pCL1]為陽性對照，檢測液加入1h即呈現藍色；** AH109[pGBKT7-lam]和AH109[pGBKT7]為陰性對照，檢測液加入8h始終呈無色；AH109[pGBKT7-cagA-N]、AH109[pGBKT7-cagA-M]、AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)]和AH109[pGBKT7-cagA-C]，與AH109[pGBKT7-cagA]一樣，檢測液加入8 h始終均呈無色。B：液相分析法定量檢測：*與Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]相比，P<0.01。獨立樣本t檢驗，n=5。圖2 β-gal活性檢測與YWHAE互作的CagA區(qū)段Fig.2 β-Galactosidase assays of the CagA fragments interacting with YWHAE

進而，采用液相分析法定量檢測各雜交組酵母二倍體胞內β-gal活性，結果顯示，Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-N](t=23.19，P<0.001)， Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-(N+M)](P<0.001)和Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-C](t=13.955,P<0.001)，與 Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA](t=9.767,P<0.001)一樣，都高于陰性對照組Y187[pGADT7]×AH109[pGBKT7]，而Y187[pGADT7-YWHAE]×AH109[pGBKT7-cagA-M]與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(圖2B)。實驗結果提示，在CagA與YWHAE蛋白相互作用中，CagA蛋白的N(1-254aa)段和C(aa 871-1146)段均參與其中。

2.2 哺乳動物細胞水平確定與YWHAE互作的CagA區(qū)段

2.2.1 Co-IP檢測確定CagA互作區(qū)段 為了進一步確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，將CagA分段蛋白的表達質粒各自與YWHAE的表達質粒共轉染COS-7細胞，用anti-FLAG抗體和Protein A&G Agarose進行Co-IP，結果顯示CagA-N和CagA-C蛋白均與完整的CagA蛋白一樣，可將過表達的外源性YWHAE蛋白沉淀，而CagA-M蛋白則無法沉淀(見圖3)。證明，在哺乳動物細胞內CagA的 N段和C段是與YWHAE發(fā)生互作的區(qū)段。

2.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測分析確定CagA互作區(qū)段 為進一步確定和YWHAE互作的CagA區(qū)段，檢測CagA-C、CagA-N對經YWHAE介導激活細胞NF-κB的影響。

共轉染YWHAE表達載體和CagA分段蛋白CagA-C或CagA-N表達載體(CagA全長蛋白，即CagA-Full表達載體組，為陽性對照)，以及pNF-κB-Luc載體，用螢火蟲熒光素酶檢測評價CagA-C、CagA-N分別與YWHAE相互作用對NF-κB的影響。結果顯示(圖4A)，CagA分段蛋白CagA-C或CagA-N組的結果和CagA-Full陽性對照組的結果類似，即，當CagA分段“C”、“N”各組單轉染CagA-C或CagA-N表達載體時，分別可見NF-κB活性增高(與空載體對照相比，tC=3.676，P=0.021；tN=4.392，P=0.012)；當CagA分段“C”、“N””各組單轉染YWHAE表達載體時，可見NF-κB活性也增高(與空載體對照相比，tC=6.046，P=0.004；tN=7.81，P=0.001)；當CagA分段“C”、“N”各組共轉染YWHAE表達載體和CagA-C或CagA-N表達載體時，NF-κB活性也增高(與空載體對照相比，tC=17.595，P<0.001；tN=12.44，P<0.001)，且均高于各自單轉染CagA-C(t=13.267，P<0.001)或YWHAE表達載體組(t=8.308，P=0.001)，CagA-N(t=28.238，P<0.001) 或YWHAE表達載體組(t=10.683，P<0.001)。

同時，當慢病毒介導的siRNA下調內源性YWHAE表達時(圖4B)，轉染CagA-C或CagA-N表達載體，NF-κB活性均無增高，與轉染CagA-Full表達載體組(t=2.18，P=0.081)，即陽性對照組的結果一致。相對應的，當維持內源性YWHAE表達水平時，與空載體對照相比，轉染CagA-C(t=4.394，P=0.007)、CagA-N(t=3.209，P=0.024) 或CagA-Full(t=4.816，P=0.005)表達載體，各自NF-κB活性均增高。

證明CagA-C、CagA-N與YWHAE相互作用可激活NF-κB，確定CagA可通過CagA-C、CagA-N段與YWHAE相互作用。

CagA各分段蛋白和YWHAE表達載體共轉染Cos-7細胞，將共轉染細胞裂解，用anti-FLAG抗體進行免疫沉淀，借助anti-FLAG或anti-Myc抗體進行Western Blot檢測。圖3 免疫共沉淀檢測Fig.3 Co-IP assays

A: YWHAE表達上調增強CagA-C、CagA-N對NF-κB的激活: 采用AGS細胞，共轉染YWHAE(Myc標簽)和CagA分段蛋白(CagA-C或CagA-N，CagA-Full為陽性對照；Flag標簽)表達載體，以及pNF-κB-Luc(報告載體)和pRL-TK(用于平衡轉染效率)?？蛰d體共轉染組作為陰性對照。轉染48 h后，收獲細胞，檢測相對熒光素酶的活性。B: YWHAE表達下調抑制CagA-C、CagA-N對NF-κB的激活: 采用AGS-siYWHAE細胞(AGS-siNC細胞為對照)，共轉染CagA分段蛋白(CagA-C或CagA-N，CagA-Full為陽性對照；Flag標簽)表達載體，以及pNF-κB-Luc和pRL-TK?？蛰d體共轉染組作為陰性對照。轉染48 h后，收獲細胞，檢測相對熒光素酶的活性。* P< 0.05，與對應的空載體對照組相比；# P< 0.01，與對應的“CagA fragment-YWHAE”組相比。配對t檢驗，n≥5。圖4 雙熒光素酶報告基因檢測Fig.4 Dual luciferase reporter assays

3 討 論

蛋白質相互作用的研究技術較多，包括酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pull-down、免疫熒光共定位、蛋白質芯片、串聯(lián)親和純化等，不同技術有其各自的優(yōu)缺點。本研究致力于檢測鑒定與YWHAE相互作用的CagA區(qū)段，吸取不同技術的優(yōu)點，從不同細胞水平開展實驗。

本研究中，首先選用酵母細胞水平進行初篩，其具有諸多優(yōu)勢，酵母細胞具真核細胞的屬性，接近體內環(huán)境，相對哺乳動物細胞，其培養(yǎng)簡單、經濟；不需蛋白抽提、純化等繁瑣操作；同時不需吸附、洗滌步驟，相對信號衰減少，提升了檢測的靈敏性。酵母雙雜交通常經檢測細胞β-gal活性來判斷蛋白相互作用，可檢測基因表達產物相互作用的累積效應，可測獲暫時或微弱的蛋白相互作用，常用方法包括瓊脂平板法、濾紙法和液相法等。前2種方法多用于大規(guī)模篩查，屬定性檢測；后1種方法常用于小規(guī)模樣品檢測，屬定量檢測。本研究選用液相法，一方面是因為本研究針對YWHAE與CagA區(qū)段的互作檢測，樣品數量少；另一方面是因為液相法(儀器檢測，定量)較濾紙法(肉眼判斷，定性)更為客觀、靈敏，與瓊脂平板法相比也更敏感。通過液相法篩查，本研究發(fā)現CagA蛋白的N端與C端均存在與YWHAE相互作用的區(qū)段，此同CagA與SHP1、TAK1的互作模式[3]存在相似。

本研究雖然在酵母水平檢測到了與YWHAE互作的CagA蛋白區(qū)段，但酵母細胞內蛋白的翻譯后加工修飾體系與哺乳動物細胞存在差異，哺乳動物細胞內的互作檢測更接近人體內的情況。因此，本研究進一步采用哺乳動物細胞系統(tǒng)對酵母系統(tǒng)篩查的結果進行鑒定。先通過經典的Co-IP實驗，將CagA蛋白區(qū)段與YWHAE分別進行一對一互作鑒定。在該項實驗中選用了Cos-7細胞，其源于經病毒SV40(起始失活突變)基因轉化的非洲綠猴腎成纖維細胞系，能表達SV40的T抗原，任何含SV40復制起點的轉染質粒，如本研究中選用的pcDNA3.1載體質粒，均能以高拷貝數進行復制，確保了外源目的蛋白的高效表達。本研究借助pcDNA3.1質粒與Cos-7細胞的組合，順利開展了Co-IP實驗，證實了CagA蛋白的N、C兩端均與YWHAE存在相互作用。

但Cos-7細胞，與幽門螺桿菌感染的環(huán)境還是存在差距，因此，本研究進一步選用了AGS細胞，一種常用的人胃腺癌細胞系，進行功能檢測驗證。通過共轉染含有5個NF-κB結合位點串聯(lián)重復序列的螢火蟲熒光素酶基因報告質粒(pNF-κB-luc)[13]，使細胞NF-κB活化效應得以放大，提高了檢測效率，最終證實，在AGS細胞內CagA的N、C兩區(qū)段均可經YWHAE介導激活細胞NF-κB，具有類似CagA全長與YWHAE互作的細胞功能[9]，從功能上驗證了CagA的N、C兩端均可分別與YWHAE互作。

綜上所述，本研究充分利用不同的蛋白相互作用研究方法，借助不同表達檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢，從多角度探明CagA通過其C-末端的“C區(qū)段”和N-末端的“N區(qū)段”與YWHAE相互作用，將有助于進一步闡明CagA與YWHAE互作的功能效應、深入揭示幽門螺桿菌CagA的致癌機制。而關于CagA的“C區(qū)段”和 “N區(qū)段”，能否單獨或組合替代CagA全長蛋白成為抗癌機制研究的靶點，還有待進一步的探究。

利益沖突：無

引用本文格式：張曉艷，溫春燕，陳豪，等. 幽門螺桿菌CagA與YWHAE互作區(qū)段的確定[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(11)：975-981. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.126