影響牛胚胎移植效果的主要因素分析

魯立剛，劉 江，曾繼晶，徐照學(xué)

(1.畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州 畢節(jié) 551700；2.畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450008)

1890年，英國劍橋大學(xué)的Walter Heape將2枚純種安哥拉兔的4細胞胚胎移植到另一只已交配3 h的比利時兔的輸卵管內(nèi)，結(jié)果生出4只比利時仔兔和2只純種安哥拉仔兔，胚胎移植技術(shù)由此創(chuàng)立[1]。此后的幾十年間，胚胎移植技術(shù)在小白鼠、大白鼠以及豬、牛、馬、綿羊、山羊等家畜上取得成功，揭開了胚胎移植技術(shù)服務(wù)于畜牧生產(chǎn)的新篇章。隨著理論研究和畜牧科技的迅速發(fā)展，胚胎移植技術(shù)得以不斷擴展與完善，成為現(xiàn)代畜牧業(yè)尤其是高價值低繁殖力畜種繁育中不可或缺的技術(shù)手段。

牛是單胎大家畜，其繁殖周期較長，繁殖力較低，用胚胎移植技術(shù)進行擴繁效果好，并且供受體牛均可反復(fù)使用，因此牛的胚胎移植技術(shù)在實際生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用。但由于胚胎移植是一個系統(tǒng)工程，受諸多因素影響，移植效果也參差不齊。本文就影響牛胚胎移植效果的主要因素進行簡要分析，以期為提高牛胚胎移植的效果提供參考。

1 供受體牛選擇

1.1 供體牛選擇

總體原則是根據(jù)胚胎移植的目的選擇供體。對于以育種純繁為目的的胚胎移植，在供體牛的選擇上主要考慮遺傳性狀、系譜關(guān)系、品種特性和生產(chǎn)性能，比如生長速度、產(chǎn)奶量等；對于以擴繁、增加群體數(shù)量等常規(guī)畜牧生產(chǎn)為目的的胚胎移植，在供體牛的選擇上主要側(cè)重于繁殖狀況、使用年限等。

此外，供體的選擇還決定著胚胎的數(shù)量與質(zhì)量。由于囊胚期前的胚胎發(fā)育主要靠母系遺傳物質(zhì)來維持，只有當(dāng)受精卵運用自己的基因組而不再是母系遺傳物質(zhì)時才能夠進入囊胚發(fā)育期階段[2]。因此，在選擇供體時，還要考慮其能否提供優(yōu)質(zhì)的卵母細胞，這樣才能獲得優(yōu)質(zhì)的早期胚胎，提高母系遺傳物質(zhì)與受體之間建立信號通路的成功率，進而提高后期的著床率。

Seidel等人證明，在具有3次以上采卵經(jīng)歷的供體母牛中，有19%～38%的牛所產(chǎn)的正常形態(tài)胚胎移植妊娠率極低或從不妊娠，西貝[3]將這種在牛胚胎移植中供體牛生產(chǎn)的形態(tài)正常的胚胎卻從不妊娠的現(xiàn)象稱為“供體牛效應(yīng)”。

總體而言，供體牛要選擇健康狀況良好，生殖系統(tǒng)發(fā)育完善，無生殖系統(tǒng)疾病，無結(jié)核、布病等傳染性疾病，具有正常的發(fā)情周期，膘情適中的青年母?；蛘呓?jīng)產(chǎn)1胎的母牛，條件允許的情況下要盡量避免“供體牛效應(yīng)”。

1.2 受體牛選擇

一般情況下，能夠正常發(fā)情配種產(chǎn)犢、具有完整的繁殖周期、體格發(fā)育正常、體況良好、體質(zhì)健康的母牛都可以作為受體牛。但在生產(chǎn)實踐中，為了保證移植效果，通常選擇生殖系統(tǒng)發(fā)育完善、發(fā)情正常的青年母牛作為受體牛。倪俊卿等[4]對2005年至2016年近12年的受體牛相關(guān)數(shù)據(jù)分析得出：青年母牛作為受體牛的妊娠率高于經(jīng)產(chǎn)母牛。

此外，受體牛的選擇還決定著母體對胚胎信號的反應(yīng)速率及胎兒的營養(yǎng)狀況。胚胎自著床起就開始與受體建立營養(yǎng)聯(lián)系，在發(fā)育早期胚胎需要的營養(yǎng)比較少，這時所選擇的受體表現(xiàn)出來的差異很?。坏S著胚胎的發(fā)育，對營養(yǎng)的需求越來越大，這時所選擇的受體對胎兒發(fā)育表現(xiàn)出明顯的影響。有研究表明：在胚胎移植后到著床這一階段，是胚胎移植能否成功的關(guān)鍵階段，其失敗率占整個胚胎移植失敗率的30%～70%[5]。并且受體與移植妊娠率、產(chǎn)犢初生重等指標有直接的關(guān)聯(lián)[6]。此外，隨著受體黃體品質(zhì)等級的下降，其妊娠率呈明顯的下降趨勢[7-8]。同時，卵巢有無彈性也影響著受體的妊娠率(分別為61.3%和44.1%)[9]。

2 超數(shù)排卵處理效果

超數(shù)排卵是指在母牛發(fā)情周期中的適當(dāng)時期人為地注射外源促性腺激素，從而促使卵巢中卵泡發(fā)育和排卵的數(shù)量大大增加的方法。在牛胚胎移植過程中，需要對供體母牛進行超數(shù)排卵處理，目的就在于能夠一次取得多枚胚胎。

供體牛超數(shù)排卵方案通常有以下幾種：(1)FSH+PG法；(2)FSH+PG+GnRH法；(3)FSH+PG+CIDR+GnRH法；(4)PMSG+PG法。

上述超數(shù)排卵處理方案(1)至(3)處理效果也有所差異。李金輝等[10]用FSH+PG法處理供體牛獲得頭均可用胚數(shù)4.2枚左右；劉俊平等[11-12]用FSH+PG+GnRH法處理供體牛獲得頭均可用胚數(shù)6.2枚左右；喬海生等[12]用CIDR+GnRH+FSH+PGF法處理供體牛獲可用胚數(shù)為5.4～8.8枚。由于方案(4)PMSG的半衰期過長，可以導(dǎo)致卵巢的過度刺激以及對排卵、受精和隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利的影響，因此現(xiàn)在一般已不采用PMSG對奶牛進行超排處理[13]。董文聽等[14]用(1)至(3)3種方案對放牧條件下西門塔爾牛進行超排處理，結(jié)果以FSH+PG+CIDR+GnRH法最好，頭均回收可用胚胎數(shù)為：國產(chǎn)FSH(7.21±3.19)枚、進口FSH(7.79±4.23)枚。FSH+PG+GnRH法次之，頭均回收可用胚胎數(shù)為：國產(chǎn)FSH(5.93±3.54)枚、進口FSH(6.76±3.79)枚。FSH+PG法效果最差，頭均回收可用胚胎數(shù)為：國產(chǎn)FSH(3.43±2.41)枚、進口FSH(4.34±2.71)枚。國產(chǎn)FSH與進口FSH超排效果差異不顯著。但秦殿武等[15]采用國產(chǎn)(寧波)和加拿大進口的FSH制劑對草原紅牛進行超排發(fā)現(xiàn)：進口的FSH超排效果要優(yōu)于國產(chǎn)的(差異顯著)。究其原因主要是商品FSH在制備提取過程中，不同廠家生產(chǎn)的FSH純度有差異；即便是同一廠家，不同生產(chǎn)批號的FSH超排效果也不盡相同。這一結(jié)論與朱玉林等的研究結(jié)果[13]是一致的。

另有研究表明：在超排處理中運用GnRH及其類似物可以提高超排效果。Foote等報道，用FSH超排后發(fā)情當(dāng)天肌肉注射GnRH采到的胚胎總數(shù)和受精率均高于未注射GnRH組[16]。

此外，牛的超排效果和攝入的營養(yǎng)水平也有很大關(guān)系。G．K．MackDonald報道：在奶牛超排處理前2周，降低日糧的蛋白水平(將蛋白水平降至12%)，增加能量水平(補飼大麥、玉米等高能量飼料)，以及適當(dāng)補充復(fù)合維生素制劑，能夠有效提高其超排效果。

3 胚胎質(zhì)量

胚胎從生產(chǎn)方式上可分為體內(nèi)胚胎和體外胚胎；從保存形式上可分為新鮮胚胎和冷凍胚胎。根據(jù)形態(tài)學(xué)標準，胚胎按質(zhì)量優(yōu)劣可分為A、B、C、D 4個等級[17-22]。一般而言，A、B、C級為可用胚胎，但C級胚胎移植成功率較低，D級胚胎不宜移植。A、B級胚胎可作冷凍，C、D級胚胎不能作冷凍。

據(jù)Broadbent、西貝等相關(guān)研究報道：相同等級的胚胎，鮮胚移植比凍胚移植的妊娠率要高8.5%～14.0%，并且無論是鮮胚或者凍胚(從A級到C級)，胚胎質(zhì)量等級越高，移植妊娠率越高。

4 供受體的同期性

在胚胎移植中，供體牛只負責(zé)生產(chǎn)胚胎，妊娠產(chǎn)犢這一過程則是由受體牛來完成的。因此，供體牛和受體牛的同期性對胚胎移植效果起著至關(guān)重要的作用。供體牛和受體牛的同期性是指二者卵巢、子宮內(nèi)環(huán)境及激素水平等趨于一致或者相近，以便于胚胎從供體子宮移植到受體子宮后能夠順利著床發(fā)育。

理論上講，供體和受體的子宮內(nèi)環(huán)境越一致或者越相近，則越有利于胚胎移植后的著床，移植妊娠率也就越高。但在實際的操作過程中，由于供體和受體的個體的差異，只可能無限接近而絕無一致的可能。通常情況下，供體牛和受體牛的發(fā)情周期在±1 d內(nèi)時(即將供體牛的胚胎移植給發(fā)情后第6～8天的受體牛)移植效果較為理想。有研究表明：通過對8 000多頭荷斯坦青年母牛采用PGF2α誘導(dǎo)同期發(fā)情，發(fā)情時間早于供體牛的受體牛，其移植妊娠率高于發(fā)情時間晚于供體的受體牛，即在發(fā)情后第8天的受體牛，其移植妊娠率高于發(fā)情后第6天的受體牛。這一研究結(jié)果在自然發(fā)情的肉牛上也得到了驗證(n=26 369)。其原因可能是發(fā)情后第8天的受體牛，其黃體功能更加完善。

基于此，有研究小組通過測定移植時受體牛的孕酮水平來驗證上述推斷，部分研究結(jié)果表明：胚移妊娠牛和不妊牛在移植時的孕酮水平?jīng)]有差異(Hasler等1980，Niemann等1985，Payas等1989，Stubbings等1980)。但是，一些研究者發(fā)現(xiàn)：當(dāng)受體母牛血液中孕酮水平為2.0～5.0 ng/mL時，移植妊娠率較高；而低于2.0 ng/mL時，移植妊娠率較低(Arave等1987，Niemann等1985，Northey等1985)。Walten等1986年報道，在胚胎移植時給受體母牛注射孕酮不能提高移植妊娠率。但是，Salgado Geiser等(1984)發(fā)現(xiàn)：給發(fā)情后5～6.5 d的受體牛注射孕酮或陰道放置孕酮釋放裝置可以提高胚移妊娠率(孕酮處理組的妊娠率為53%，對照組為37%)。Geisert等1991年也報道：給發(fā)情后5 d的受體牛注射孕酮，同時給受體牛移植8日齡的胚胎，結(jié)果表明注射孕酮可以降低由于非同期性對妊娠率的影響(注射孕酮組的妊娠率為47%，對照組僅為5%)。

因此，要提高胚胎移植妊娠率，供體牛和受體牛的同期性是關(guān)鍵。對于發(fā)情時間稍晚于供體胚胎日齡的受體牛(即不到發(fā)情后第7天的受體牛)，適時注射孕酮有利于受胎，但注射的確切時間還有待于更進一步研究。

5 操作技術(shù)

在胚胎移植過程中，術(shù)者的技術(shù)熟練程度也是影響胚胎移植效果的重要因素，主要表現(xiàn)在胚胎解凍、移植槍通過子宮頸的技巧、胚胎移植部位、是否導(dǎo)致子宮內(nèi)膜損傷出血、以及移植所用時間等方面。

5.1 胚胎解凍

將胚胎細管從液氮中取出，置于空氣中10 s，然后再將其置于35～38 ℃溫水中水浴10 s，剪掉封口端后即可裝槍移植。Hillier等認為，若將胚胎自液氮中取出后直接放入35～38 ℃的恒溫水浴中進行解凍，胚胎易出現(xiàn)透明帶破裂現(xiàn)象。

5.2 移植槍通過子宮頸的技巧

由于子宮頸的特殊褶皺結(jié)構(gòu)，移植槍通過子宮頸的時候應(yīng)采取試探性的方式柔性、緩慢通過。如果在前進過程中遇到阻力，則需將移植槍略微后退，調(diào)整前進方向后旋轉(zhuǎn)通過，切忌用力過猛造成子宮頸損傷。

5.3 胚胎移植部位

移植槍通過子宮頸后，繼續(xù)插入有黃體一側(cè)子宮角深部1/2～1/3處，原則是在不造成子宮角損傷的前提下盡可能靠前，越深越好。

5.4 移植所用時間

胚胎移植過程中所需時間主要取決于術(shù)者的技術(shù)操作熟練程度，通常應(yīng)將操作時間控制在5 min內(nèi)，原則上不超過10 min。

6 營養(yǎng)及飼養(yǎng)管理水平

為了提高牛胚胎移植的效果，受體牛的營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理水平也不可忽視。

(1)在移植前受體牛最好單獨組群飼養(yǎng)，這樣既便于飼養(yǎng)管理又能保持養(yǎng)殖環(huán)境的相對穩(wěn)定，減少應(yīng)激的發(fā)生。

(2)在日糧搭配上，蛋白和能量水平要均衡，礦物質(zhì)和維生素也不可或缺，以保證受體牛正常的營養(yǎng)需求，維持良好的體況和膘情。受體牛通常在移植前45 d開始補飼，保持日增重0.30～0.40 kg，同時注射VA、VB、VD、VE針劑或補飼多維、鈣、磷、鋅、硒等微量元素。

(3)應(yīng)加強對受體牛的日常管理，驅(qū)蟲、保健、免疫等常規(guī)管理措施也必不可少，保持受體牛每天有充足的運動量。

(4)產(chǎn)前3個月要滿足對營養(yǎng)的全面需要，尤其是蛋白質(zhì)的需要，補充足量的維生素、微量元素，適當(dāng)限制能量攝入，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免難產(chǎn)。

(5)圍產(chǎn)期密切觀察，做好受體牛分娩及產(chǎn)后保健、初生犢牛維護，有效降低犢牛死亡率。

7 結(jié) 語

牛的胚胎移植是一個系統(tǒng)工程，影響環(huán)節(jié)和因素眾多，每個環(huán)節(jié)和因素都能牽一發(fā)而動全身，影響最終的移植效果。要想獲得理想的移植效果，每一個環(huán)節(jié)都必須做到盡善盡美。此外，由于牛胚胎移植的成本較高，整個過程對技術(shù)要求較為苛刻，因此，不斷提高牛胚胎移植妊娠率、產(chǎn)犢率將一直是廣大畜牧科技工作者孜孜以求的奮斗目標。