環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)對慢性阻塞性肺疾病急性加重伴下呼吸道感染的診斷價值

溫雅，杜焰家，黃娟，曾漢華，鐘子雙，張偉強(qiáng)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）的常見合并癥，但長期接受抗感染治療的AECOPD患者細(xì)菌耐藥情況嚴(yán)重、治療難度增加［1］。目前，臨床上主要通過呼吸道病原菌培養(yǎng)方法明確AECOPD伴下呼吸道感染患者的致病菌，但該方法耗時較長，容易錯過最佳治療時機(jī)［2］。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）可以進(jìn)行多種細(xì)菌、結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測，具有快速、敏感等優(yōu)勢，可早期明確致病菌，為抗菌藥物的選擇提供依據(jù)［3-4］。鑒于LAMP的優(yōu)勢，將其用于AECOPD伴下呼吸道感染的診斷或可進(jìn)一步提高其診斷效能。為此，本研究分析了LAMP對AECOPD伴下呼吸道感染的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020—2021年在梅州市人民醫(yī)院住院的AECOPD伴下呼吸道感染患者500例，均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重診治中國專家共識（草案）》［5］中的AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)檢查確診為下呼吸道感染，血清炎癥指標(biāo)升高，提示伴有下呼吸道細(xì)菌或非典型病原體或結(jié)核桿菌感染。所有患者中男433例，女67例；年齡（72.2±9.9）歲；有吸煙史316例（占63.20%）；行機(jī)械通氣328例（占65.60%）；合并癥：高血壓137例（占27.40%），冠心病73例（占14.60%），2型糖尿病52例（占10.40%）。本研究經(jīng)梅州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（梅市倫審2020-CY-18）。

1.2 納入、排除及剔除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～100歲；（2）患者和/或家屬同意留取痰液或支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）并送檢；（3）采用敏感抗生素治療或抗結(jié)核治療有效。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不適合行電子支氣管鏡檢查及鏡下支氣管肺泡灌洗術(shù)者；（2）合并其他臟器嚴(yán)重感染、HIV感染者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）采集的標(biāo)本不符合臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)者；（2）檢測結(jié)果提示可能存在標(biāo)本污染者。

1.3 研究方法 本研究為橫斷面研究?；颊呷朐汉罅羧√狄夯駼ALF，同時采用LAMP和病原菌（細(xì)菌、真菌、結(jié)核分枝桿菌）培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測。共500份標(biāo)本采用LAMP方法檢測，其中痰液336份、BALF 164份；共530份標(biāo)本采用病原菌培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測，其中28例患者同時進(jìn)行細(xì)菌+真菌和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，2例患者同時進(jìn)行兩份細(xì)菌+真菌培養(yǎng)。

1.3.1 BALF、痰液的采集及處理 參考《成人診斷性可彎曲支氣管鏡檢查術(shù)應(yīng)用指南（2019年版）》［6］及《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》［7］操作規(guī)范。電子支氣管鏡檢查術(shù)前做好禁食禁水準(zhǔn)備，采取利多卡因局部麻醉/局部麻醉+鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的麻醉方式；術(shù)中全程監(jiān)測患者呼吸、血壓、脈搏、指脈氧，觀察患者的臨床癥狀；術(shù)后囑患者禁食、禁水2 h，并觀察患者術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生情況。根據(jù)胸部CT定位將支氣管鏡經(jīng)鼻插入至目標(biāo)亞段支氣管，病變局限者選擇病變段，彌漫性病變者選擇右肺中葉或左上葉舌段，清除局部痰液后注入室溫0.9%氯化鈉溶液30～60 ml，進(jìn)行病變部位支氣管肺泡灌洗，回收15～30 ml BALF，要求回收率≥30%?；颊咴卺t(yī)務(wù)人員指導(dǎo)下自主咳出深部痰液或在電子支氣管鏡下吸出痰液，標(biāo)本符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第4版）》［8］，2 h內(nèi)送檢實驗室。

1.3.2 LAMP LAMP為呼吸道病原菌核酸聯(lián)合檢測，首先采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（博奧生物集團(tuán)有限公司）提取病原菌DNA，按照呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒（博奧生物集團(tuán)有限公司）說明書，采用等溫擴(kuò)增法和微流控芯片法相結(jié)合的方法，對病原菌進(jìn)行檢測，24 h內(nèi)可獲得結(jié)果。采用呼吸道病原菌核酸檢測軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行可視化分析，本研究共檢測到13種病原菌：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

1.3.3 病原菌培養(yǎng)方法 按照臨床常規(guī)細(xì)菌/真菌培養(yǎng)操作標(biāo)準(zhǔn)，將標(biāo)本接種在已處理的培養(yǎng)皿中，經(jīng)恒溫培養(yǎng)箱，采用VITEK2自動微生物分析儀檢測細(xì)菌，采用真菌分析儀檢測真菌，采用液基培養(yǎng)方法檢測結(jié)核分枝桿菌。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示；計數(shù)資料以〔n（%）〕表示，組間比較采用χ2檢驗或McNemar配對檢驗；LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測病原菌的一致性分析采用Kappa檢驗，其中Kappa值≥0.75提示一致性高、0.40≤Kappa值＜0.75提示一致性一般、Kappa值＜0.40提示一致性差。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測結(jié)果 LAMP檢測結(jié)果顯示，BALF中病原菌檢出率為30.49%（50/164），痰液中病原菌檢出率為45.24%（152/336）；痰液中病原菌檢出率高于BALF，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.958，P=0.002）。其中行機(jī)械通氣者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌檢出率及單一感染發(fā)生率高于未行機(jī)械通氣者，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢出率低于未行機(jī)械通氣者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；行機(jī)械通氣者與未行機(jī)械通氣者肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌檢出率及混合感染發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 行機(jī)械通氣者與未行機(jī)械通氣者LAMP檢測結(jié)果比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of LAMP detection results between patients with mechanical ventilation and patients without mechanical ventilation

2.2 LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測結(jié)果比較 采用LAMP檢出病原菌202份，病原菌檢出率為40.40%（202/500）；采用病原菌培養(yǎng)方法檢出病原菌130份，病原菌檢出率為24.53%（130/530）。LAMP的病原菌檢出率高于病原菌培養(yǎng)方法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=29.671，P＜0.001）。其中LAMP對肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、單一感染、混合感染檢出率高于病原菌培養(yǎng)方法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測結(jié)果比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of detecting result between LAMP and pathogen culture

2.3 LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測病原菌結(jié)果的一致性LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測銅綠假單胞菌結(jié)果的Kappa值為0.708，檢測金黃色葡萄球菌結(jié)果的Kappa值為0.611，檢測嗜麥芽窄食單胞菌結(jié)果的Kappa值為0.421，見表3。

表3 LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測病原菌結(jié)果的一致性分析（例）Table 3 Consistency analysis of LAMP and pathogen culture methods in detecting pathogenic bacteria

3 討論

下呼吸道感染是誘發(fā)AECOPD的主要因素之一，尤其是肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌，其進(jìn)入下呼吸道后會損傷患者肺功能，加重患者咳喘、呼吸困難癥狀，甚至危及患者生命［9］。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以老年男性為主，大部分患者有吸煙史，接受過機(jī)械通氣治療。老年患者機(jī)體功能減退，抵抗力減弱，容易并發(fā)下呼吸道感染；煙草中的尼古丁、一氧化碳等有毒物質(zhì)會加重COPD患者的呼吸道損傷，增加病原菌感染風(fēng)險；接受機(jī)械通氣治療亦可增加呼吸道感染發(fā)生概率［10-11］。目前，臨床上主要通過臨床特征與癥狀及胸部CT檢查結(jié)果確定COPD患者是否伴發(fā)下呼吸道感染［12］，但無法明確其感染病原菌的類型，故需要進(jìn)一步明確病原菌以采取針對性治療。但由于病原菌的體外培養(yǎng)條件苛刻，且培養(yǎng)時間較長，假陰性結(jié)果較多，導(dǎo)致僅有部分COPD患者可在痰液中發(fā)現(xiàn)病原菌［13］。

近年來隨著支氣管肺泡灌洗技術(shù)的廣泛應(yīng)用，BALF檢查得到普及，這為AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌檢測提供了有利條件［14］。本研究結(jié)果顯示，痰液中病原菌檢出率高于BALF，其原因可能與痰液中病原菌含量更高有關(guān)；且LAMP對病原菌的檢出率高于病原菌培養(yǎng)方法。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以單一感染為主，革蘭陰性菌感染居多，其中行機(jī)械通氣者以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌感染為主，未行機(jī)械通氣者以流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染為主，且行機(jī)械通氣者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率高于未行機(jī)械通氣者。既往研究表明，我國下呼吸道感染患者感染病原菌以革蘭陰性菌為主，其中肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌均為常見條件致病菌，其廣泛存在于自然界，對免疫力低下者可造成嚴(yán)重危害；銅綠假單胞菌具有黏多糖與鞭毛，容易黏附在呼吸道黏膜上皮，引起呼吸道感染［15-17］。一項病原菌分離及耐藥研究顯示，不同病程的COPD患者感染的病原菌均以革蘭陰性菌為主，主要為鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等［18］。國外研究表明，AECOPD患者采用痰培養(yǎng)分離出的病原菌主要為銅綠假單胞菌（38.23%）、肺炎克雷伯菌（29.41%）、金黃色葡萄球菌（23.53%）、肺炎鏈球菌（5.88%）［19］。因COPD患者經(jīng)常使用抗生素、糖皮質(zhì)激素及接受機(jī)械通氣治療，故其常伴有肺部重癥感染，導(dǎo)致條件致病菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染比例升高［20］。此外，老年COPD患者因氣道慢性炎癥也容易并發(fā)結(jié)核分枝桿菌感染［21-23］。上述研究結(jié)果存在的差異亦提示，下呼吸道感染的病原菌分布可能與地域、種族、合并疾病、治療方法等有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，LAMP對肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌的檢出率高于病原菌培養(yǎng)方法，提示LAMP對于一些苛養(yǎng)菌、條件致病菌的診斷效能較病原菌培養(yǎng)方法好，對于病原菌培養(yǎng)方法容易檢測的病原菌，LAMP也較敏感；但LAMP與病原菌培養(yǎng)方法檢測銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌結(jié)果的一致性一般，檢測其他病原菌結(jié)果的一致性較差。LAMP是一種利用分子生物學(xué)分析病原菌核酸的檢測技術(shù)，可同時分析十多種常見病原菌，故可為AECOPD伴下呼吸道感染患者的抗菌藥物選擇提供依據(jù)；此外，該技術(shù)最快可在2 h內(nèi)出具檢測結(jié)果，具有迅速、便捷等優(yōu)點［24-26］。

綜上所述，與病原菌培養(yǎng)方法相比，LAMP對AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌檢出率更高，尤其是肺炎鏈球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌或條件致病菌；且采用LAMP檢測AECOPD伴下呼吸道感染患者時，其痰液中病原菌檢出率高于BALF。但本研究為單中心研究，且樣本量有限，未來仍需要多中心、大樣本量研究進(jìn)一步驗證本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：溫雅、杜焰家進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計、結(jié)果分析與解釋；溫雅、張偉強(qiáng)進(jìn)行研究的實施與可行性分析；溫雅、黃娟、曾漢華、鐘子雙進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；溫雅撰寫、修訂論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。