慢性腦低灌注小鼠模型構(gòu)建及其認(rèn)知功能研究

郭文娟，孫慶玲，李婷，魏明清，倪敬年，時(shí)晶

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是導(dǎo)致腦小血管疾病的主要原因［1-2］，也是認(rèn)知功能下降和神經(jīng)退行性改變的主要致病因素［3-4］。目前，大鼠和小鼠CCH模型構(gòu)建方法包括雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）法、雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）法、雙側(cè)椎動(dòng)脈+雙側(cè)頸總/內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎（bilateral vertebral artery+bilateral common/internal carotid artery ligation，4VO）法、漸進(jìn)式頸總動(dòng)脈狹窄（gradual common carotid artery stenosis，GCAS）法和非對(duì)稱性頸總動(dòng)脈縮窄（asymmetric common carotid artery stenosis，ACAS）法，其中臨床應(yīng)用最廣泛的是微彈簧BCAS法，但微彈簧成本較高，且無法采用MRI進(jìn)行掃描；如采用離體腦組織進(jìn)行MRI檢查又無法繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，且檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)結(jié)果之間可能存在誤差。因此，優(yōu)化CCH模型構(gòu)建方法對(duì)腦小血管疾病和血管性認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制、病理特征、治療方法的研究非常重要。本次實(shí)驗(yàn)參照MANSOUR等［5］改良版BCAS法構(gòu)建CCH大鼠模型的方法，使用一個(gè)非固定29號(hào)鈍針使頸動(dòng)脈縮窄，但不留在體內(nèi)的方法改良了微彈簧BCAS法，進(jìn)而使小鼠滿足活體MRI掃描的條件，并分析改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型的認(rèn)知功能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2022年4—5月。選取30只雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量24～29 g，8～9周齡，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXY（北京）2019-0013〕。將所有小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，各15只。所有小鼠被安置在恒溫（25 ℃）、相對(duì)濕度為40%～60%的環(huán)境中，每籠5只小鼠。所有小鼠的飼養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)定，并遵循動(dòng)物倫理和福利原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 模型組小鼠采用改良微彈簧BCAS法構(gòu)建CCH模型，具體如下：通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用無菌器械沿小鼠頸部中部切開皮膚和皮下組織，采用玻璃分針緩慢分離迷走神經(jīng)，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）。使用直徑0.08 mm的非吸收外科縫合線，將直徑0.18 mm的鋼絲與CCA牢固結(jié)扎，見圖1；然后緩慢抽出鋼絲，觀察有血流通過則縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅分離兩側(cè)CCA，隨后縫合消毒。手術(shù)過程中保持直腸溫度為36.5～37.5 ℃。

圖1 改良微彈簧BCAS法構(gòu)建CCH模型示意圖Figure 1 Schematic diagram of CCH model constructed by improved microcoil BCAS method

1.3 MRI檢查 術(shù)后第1天采用1.5%～2.0%異氟烷麻醉小鼠，使用動(dòng)物生理檢測(cè)器測(cè)量小鼠呼吸頻率，以70～80次/min為宜。采用Bruker7.0 T小動(dòng)物磁共振成像設(shè)備（型號(hào)：BioSpec 70/16USR）進(jìn)行MRI檢查，采用T2WI序列獲取全腦軸向圖像。小鼠俯臥在小動(dòng)物MRI掃描床上，頭部固定在專用線圈內(nèi)，MRI掃描過程中通過鼻導(dǎo)管維持麻醉狀態(tài)。T2WI序列參數(shù)：TR 2 500 ms，TE 35 ms，F(xiàn)OV 20 mm×20 mm，層數(shù)20，層厚0.5 mm，矩陣256×256，掃頻時(shí)間5′20″，回波間隔11.667 ms。

1.4 激光散斑對(duì)比成像（laser speckle contrast imaging，LSCI）檢測(cè)小鼠腦血流量（cerebral blood flow，CBF）及低灌注區(qū)占比 所用儀器為激光散斑血流成像儀（SIM BFI HR Pro，武漢迅微光電技術(shù)有限公司生產(chǎn)），將三目立體顯微鏡（OLYMPUS生產(chǎn)）與計(jì)算機(jī)連接，進(jìn)行實(shí)時(shí)定位和校準(zhǔn)。術(shù)后第1天、1個(gè)月和2個(gè)月，分別從假手術(shù)組和模型組隨機(jī)挑選5只小鼠，稱重后腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，剪開小鼠頭頂皮膚并消毒，剝離骨膜暴露頭骨，將小鼠置于臺(tái)式顯微鏡下20 cm處。CBF檢測(cè)過程中，在小鼠頭骨頂部滴入0.9%氯化鈉溶液，以保持頂骨測(cè)試區(qū)域濕潤(rùn)。LED光強(qiáng)度為4 000，光學(xué)倍數(shù)為12，亮度為1.5級(jí)，采樣頻率為57幀/s，曝光時(shí)間為15 ms，分辨率為1 024×758像素。利用Image J中的“Split Channels”功能對(duì)3個(gè)RGB通道進(jìn)行分割統(tǒng)計(jì)，然后計(jì)算低灌注區(qū)占比［6］。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力兩組小鼠均于術(shù)后2個(gè)月進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其學(xué)習(xí)和記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括一個(gè)圓形水池（直徑100 cm，高50 cm）、一個(gè)平臺(tái)（直徑5 cm）、一架跟蹤攝像機(jī)和一臺(tái)電腦。將（23±1）℃的水注入水池至30 cm深度，水面高于平臺(tái)1 cm。將攝像機(jī)置于水池中心上方200 cm處，記錄動(dòng)物的位置、游泳距離、游泳時(shí)間及游泳路徑。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位導(dǎo)航和空間探索兩部分。實(shí)驗(yàn)前5 d進(jìn)行定位導(dǎo)航，將水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)位于其中一個(gè)象限的中心。記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間（s），即逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)前3 d，如果小鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間超過60 s，則引導(dǎo)其到平臺(tái)停留10 s。實(shí)驗(yàn)第4、5天，無論小鼠是否找到平臺(tái)，都不再進(jìn)行訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索，將平臺(tái)移走，將小鼠從原平臺(tái)象限的對(duì)面放入水中，記錄其在60 s內(nèi)穿過平臺(tái)象限的次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本研究計(jì)量資料均為偏態(tài)分布，以M（QR）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI檢查結(jié)果 T2WI顯示，術(shù)后第1天兩組小鼠均未發(fā)生急性腦梗死及其他異常改變。

2.2 CBF和低灌注區(qū)占比 術(shù)后第1天、1個(gè)月、2個(gè)月，模型組小鼠CBF少于假手術(shù)組，低灌注區(qū)占比高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月，模型組小鼠CBF多于術(shù)后第1天，低灌注區(qū)占比低于術(shù)后第1天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠術(shù)后不同時(shí)間CBF和低灌注區(qū)占比比較〔M（QR），n=5〕Table 1 Comparison of CBF and proportion of hypoperfusion area between the two groups at different time after operation

2.3 游泳距離、逃避潛伏期、60 s內(nèi)穿過平臺(tái)次數(shù) 實(shí)驗(yàn)第1、2天，兩組小鼠游泳距離比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，模型組小鼠游泳距離長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4、5天，模型組小鼠逃避潛伏期長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。實(shí)驗(yàn)第6天，假手術(shù)組小鼠60 s內(nèi)穿過平臺(tái)象限的次數(shù)為1（2）次，多于模型組的0（1）次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=391，P＜0.05）。

表2 兩組小鼠訓(xùn)練不同時(shí)間游泳距離和逃避潛伏期比較〔M（QR），n=15〕Table 2 Comparison of swimming distance and escape latency between the two groups at different training time

3 討論

CCH是血管性認(rèn)知障礙、癡呆的主要發(fā)病機(jī)制，故CCH模型的構(gòu)建方法一直被不斷探索。嚙齒類動(dòng)物常被用于探索CCH或血管性癡呆發(fā)病機(jī)制、病理特征的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，其中C57BL/6J小鼠因后循環(huán)腦血管解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育不全［7］，可彌補(bǔ)后椎動(dòng)脈代償供血情況，故被認(rèn)為是構(gòu)建CCH的理想動(dòng)物。MANSOUR等［5］提出使用直徑為0.18 mm的微彈簧縮窄C57BL/6J小鼠CCA，可避免BCCAO法構(gòu)建CCH模型誘發(fā)的視神經(jīng)損傷［7］，且術(shù)后即刻小鼠CBF明顯減少，術(shù)后30 d可恢復(fù)到術(shù)前的80%［8］，進(jìn)而成功模擬CCH狀態(tài)。

既往研究表明，CCH小鼠模型可再現(xiàn)血管性認(rèn)知障礙的臨床特征和病理特征，引起小鼠認(rèn)知障礙、CBF減少、皮質(zhì)下白質(zhì)損傷［9-11］及空間記憶功能損傷［12］。但微彈簧的金屬材質(zhì)無法用于MRI掃描，且其價(jià)格昂貴。而本研究中改良微彈簧BCAS法是采用縫合線代替微彈簧來縮窄CCA，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了活體MRI掃描，且可以降低建模成本。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第1天、1個(gè)月、2個(gè)月，模型組小鼠CBF少于假手術(shù)組；術(shù)后1、2個(gè)月，模型組小鼠CBF多于術(shù)后第1天；提示模型組小鼠術(shù)后2個(gè)月仍維持低灌注狀態(tài)。本研究結(jié)果還顯示，術(shù)后第1天、1個(gè)月、2個(gè)月，模型組小鼠低灌注區(qū)占比高于假手術(shù)組，模型組小鼠低灌注區(qū)占比低于術(shù)后第1天，再次佐證了模型組小鼠可以維持低灌注狀態(tài)。且模型組小鼠術(shù)后第1天未發(fā)生急性腦梗死及其他異常改變，這與微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型一致［13］。本研究結(jié)果還顯示，實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，模型組小鼠游泳距離長(zhǎng)于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4、5天，模型組小鼠逃避潛伏期長(zhǎng)于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)第6天，模型組小鼠60 s內(nèi)穿過平臺(tái)象限的次數(shù)多于假手術(shù)組，提示通過改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型可損傷小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

綜上所述，通過改良微彈簧BCAS法構(gòu)建的CCH小鼠模型彌補(bǔ)了微彈簧無法進(jìn)行活體MRI掃描的缺陷，且能維持低灌注狀態(tài)，小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶能力受損，這為探究CCH發(fā)病機(jī)制提供了新的建模思路。

作者貢獻(xiàn)：郭文娟、李婷、時(shí)晶進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；郭文娟、孫慶玲、李婷進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；郭文娟、李婷進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；孫慶玲、李婷、魏明清、倪敬年進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；郭文娟負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；時(shí)晶負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。