UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI平臺(tái)快速鑒定雞骨草化學(xué)成分 Δ

郭忠會(huì) ，鄭雪瑩 ，梁潔 ，譚勇 ，覃春萍 ，郭家成 ，李耀華 ，韋志英 ，陳奎奎 （.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 53000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，南寧 53000）

雞骨草系豆科植物廣州相思子Abrus cantoniensis Hance的干燥全株，壯藥名“棵骼給”，為廣西“桂十味”道地藥材之一。其性涼，味甘，具有利濕退黃、清熱解毒、疏肝止痛的功效[1]，臨床常用于治療慢性乙型肝炎等肝臟疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，雞骨草有降脂保肝、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、抗氧化等多種生物活性[2]?；瘜W(xué)成分是中藥多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，關(guān)于雞骨草化學(xué)成分的研究多集中在雞骨草全草或提取物的成分分離制備，以及基于高效液相色譜技術(shù)的指紋圖譜分析和相思子堿、下箴刺桐堿、夏佛塔苷等主成分的含量測(cè)定方面[3―4]，而對(duì)于雞骨草化學(xué)成分系統(tǒng)分析的研究鮮有報(bào)道。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，已廣泛用于中藥化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)表征[5]。全信息串聯(lián)質(zhì)譜法作為數(shù)據(jù)依賴型串聯(lián)質(zhì)譜法的一種，具有全面、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈活的特點(diǎn)，可為成分解析提供充足、可靠的數(shù)據(jù)源。此外，UNIFI平臺(tái)功能強(qiáng)大，具有自動(dòng)離子流提取、預(yù)測(cè)分子式、商用/自建數(shù)據(jù)庫檢索等功能，可實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分快速、靶向分析，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)后處理方面展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景?；诖耍狙芯渴紫冉PLC-Q-TOF/MS分析方法，基于全信息串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，全面采集雞骨草質(zhì)譜數(shù)據(jù)；然后整理關(guān)于雞骨草化學(xué)成分的文獻(xiàn)報(bào)道，建立雞骨草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫；再利用UNIFI平臺(tái)，通過靶向與非靶向分析快速解析雞骨草的化學(xué)成分，以期為雞骨草藥效物質(zhì)的闡釋、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

Acquity UPLC Ⅰ-Class型超高效液相色譜系統(tǒng)、Xevo G2-XS Q Tof型四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有UNIFI科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)V1.7和Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站）均購自美國Waters公司；Q-250A3型高速多功能粉碎機(jī)購自上海冰都電器有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

雞骨草藥材購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院譚勇教授鑒定為豆科植物廣州相思子A. cantoniensis Hance的干燥地上部分。下箴刺桐堿、牡荊素、異牡荊素、木犀草素4種對(duì)照品（批號(hào)分別為RFS-X06801909002、RFS-M02302002022、RFS-Y11602-107028、RFS-M00702004028，純度均大于98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；葫蘆巴堿、芒柄花素、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、維采寧-Ⅱ5種對(duì)照品（批號(hào)分別為AF21062651、AF20052952、AF21061501、AF21062602、AF20112508，純度均大于98%）均購自成都埃法生物科技有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲醇、甲酸均購自美國Fisher公司；亮氨酸-腦啡肽（批號(hào)為ST158449，純度大于98%）購自美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取雞骨草適量，粉碎，過2號(hào)篩，精密稱取雞骨草粉末50 mg，加入10 mL 80%甲醇，渦旋2 min，超聲（功率150 W，頻率50 kHz）溶解30 min，靜置放冷，過濾，收集濾液，以12 000 r/min 離心 15 min，取上清液，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取9個(gè)對(duì)照品粉末各適量，分別用少量二甲基亞砜助溶，以80%甲醇為溶劑，配制成單個(gè)對(duì)照品貯備液（1 mg/mL）及混合對(duì)照品溶液（10 μg/mL），4 ℃避光保存，備用。

2.2 檢測(cè)條件

2.2.1 色譜條件 采用ACQUITY PRM HSS T3 FIT 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）、乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，5%B；3～10 min，5%B→10%B；10～20 min，10%B→30%B；20～30 min，30%B→65%B；30～35 min，65%B→95%B；35～37 min，95%B→100%B；37～40 min，100%B）；進(jìn)樣體積為2 μL；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）50～1 500。優(yōu)化的儀器參數(shù)如下：在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，毛細(xì)管電壓分別為3.0 kV（+）和2.5 kV（－）；錐孔電壓為40 V，錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑氮?dú)饬髁繛?00 L/h，氬氣流量為0.15 mL/min，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為300 ℃，低能通道中碰撞能量設(shè)置為6 V，高能通道中碰撞能量設(shè)置為20～35 V。亮氨酸-腦啡肽（100 ng/L）用作Lock Spray實(shí)時(shí)校正，流速為10 μL/min。

2.3 數(shù)據(jù)后處理

（1）以“雞骨草”“Abrus cantoniensis Hance”為檢索詞，通過檢索中國知網(wǎng)、PubMed等數(shù)據(jù)庫，收集、整理雞骨草所含化學(xué)成分的信息，建立雞骨草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。（2）將質(zhì)譜“原始數(shù)據(jù)”和“雞骨草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI V1.7平臺(tái)，進(jìn)行靶向分析。參數(shù)設(shè)置：高能量強(qiáng)度閾值50.0，低能量強(qiáng)度閾值400.0；精確質(zhì)量數(shù)偏差±5.0 mDa，保留時(shí)間容差0.1 min；正離子模式下選擇[M+H]+、[M+Na]+為加合離子，負(fù)離子模式下選擇[MH]－、[M+HCOO]－為加合離子；正離子校正質(zhì)量數(shù)為556.276 6，負(fù)離子校正質(zhì)量數(shù)為554.262 0。對(duì)于UNIFI平臺(tái)靶向匹配的化合物，需通過對(duì)照品比較、質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較、文獻(xiàn)比較等方法進(jìn)一步確證，以排除假陽性結(jié)果。（3）采用UNIFI V1.7平臺(tái)和Masslynx 4.1軟件，通過元素匹配、二級(jí)碎片分析及特征碎片、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息比較和對(duì)照品比較等多種方法，對(duì)未匹配的化合物進(jìn)行非靶向分析。

3 結(jié)果與分析

采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI平臺(tái)對(duì)雞骨草和混合對(duì)照品進(jìn)行采集和分析，得到正、負(fù)離子模式的基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC），見圖1。結(jié)果顯示，共鑒定出46種化合物，包括靶向分析的27種化合物和非靶向分析的19種化合物。其中，黃酮類化合物有19種，三萜類化合物有8種，生物堿類化合物有3種，有機(jī)酸類化合物有5種，其他類化合物有11種。通過與對(duì)照品比對(duì)確證了9種化合物。雞骨草中化學(xué)成分的詳細(xì)分析結(jié)果見表1。

表1 基于UPLC-Q-TOF/MS的雞骨草化學(xué)成分分析結(jié)果

續(xù)表1

圖1 正、負(fù)離子模式下雞骨草樣品和混合對(duì)照品的BPC圖

3.1 黃酮類成分鑒定

從雞骨草中鑒定出19種黃酮類化合物，主要包括黃酮碳苷類和黃酮苷元類，其中有7種化合物經(jīng)對(duì)照品比對(duì)確證。

3.1.1 黃酮碳苷類 黃酮碳苷類成分的裂解方式常以糖環(huán)的交叉環(huán)切除反應(yīng)為主，五碳糖結(jié)構(gòu)常發(fā)生C3H6O3（90 Da）、C2H4O2（60 Da）等中性丟失產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子，六碳糖結(jié)構(gòu)常發(fā)生C4H8O4（120 Da）、C3H6O3（90 Da）等中性丟失產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子[9]。本研究以化合物F6為例詳細(xì)介紹其鑒定過程?；衔颋6的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 563.140 9[M－H]－，推測(cè)其化學(xué)式為C26H28O14。碎片離子m/z 473.109 2[M－H－C3H6O3]－、443.099 0[MH－C4H8O4]－、383.078 4[M－H－C4H8O4－C2H4O2]－和353.068 1[M－H－C4H8O4－C3H6O3]－可由準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生特征中性丟失C3H6O3（90 Da）、C4H8O4（120 Da）、C6H12O6（180 Da）、C7H14O7（210 Da）產(chǎn)生。此外，碎片離子m/z 353.068 1繼續(xù)丟失1分子CO，獲得碎片離子m/z 325.073 0[M－H－C4H8O4－C3H6O3－CO]－；碎片離子m/z 545.129 4[M－H－H2O]－可由準(zhǔn)分子離子峰丟失1分子H2O產(chǎn)生。通過與文獻(xiàn)[6―10]和對(duì)照品比對(duì)鑒定化合物F6為夏佛塔苷，其在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖2 負(fù)離子模式下夏佛塔苷的質(zhì)譜圖和可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.1.2 黃酮苷元類 本類黃酮成分常發(fā)生C環(huán)的逆迪爾斯阿爾德裂解（Retro Diels-Alder reaction，RDA）和CH3、CO的中性丟失[6]。本研究以化合物F17為例詳細(xì)介紹該類成分的鑒定過程?；衔颋17的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 267.066 6[M－H]－，推測(cè)其化學(xué)式為C16H12O4。準(zhǔn)分子離子峰分別發(fā)生1分子CH3和1分子CO中性丟失，得到碎片離子m/z 252.047 0[M－H－CH3]－和m/z 239.172 4[M－H－CO]－；準(zhǔn)分子離子峰在C環(huán)1，3處發(fā)生RDA裂解，得到碎片離子m/z 132.022 3[M－HC7H5O3]－。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫和對(duì)照品比對(duì)，鑒定化合物F17為芒柄花素，其在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖3 負(fù)離子模式下芒柄花素的質(zhì)譜圖和可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.2 三萜類

在本研究中，三萜類成分的出峰順序較靠后，共鑒定出8種三萜類化合物，該類化合物的裂解規(guī)律如下：（1）易脫去糖基、H2O、CO等中性分子；（2）在B、C環(huán)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的碎片峰；（3）具有?12-齊墩果烯結(jié)構(gòu)的三萜類化合物，C環(huán)易發(fā)生RDA[11]。本研究以化合物T3為例詳細(xì)介紹其鑒定過程。低能量通道質(zhì)譜圖顯示，化合物T3的加合離子峰為m/z 949.517 8[M+Na]+，推測(cè)其化學(xué)式為C48H78O17。高能量通道質(zhì)譜圖顯示，碎片離子m/z 599.389 4[M+H－Rha－Glu－H2O]+可由母離子丟失1分子鼠李糖、葡萄糖和H2O產(chǎn)生；碎片離子m/z 441.372 4[M+H－Rha－Glu－GluA]+可由母離子丟失1分子鼠李糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸產(chǎn)生；碎片離子m/z 425.377 6[M+H－Glu－Rha－OGluA]+可由糖苷結(jié)構(gòu)脫去糖鏈產(chǎn)生，其繼續(xù)丟失1分子H2O可產(chǎn)生碎片離子m/z 407.368 9，繼續(xù)發(fā)生RDA產(chǎn)生m/z 217.190 5[M+H－Glu－Rha－OGluA－H2O－C14H22]+的碎片。經(jīng)與參考文獻(xiàn)[11―14]和數(shù)據(jù)庫匹配，鑒定化合物T3為槐花皂苷Ⅲ，其在正離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 正離子模式下槐花皂苷Ⅲ的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 生物堿類

在雞骨草中共鑒定出3種生物堿類化合物，其中有2種經(jīng)對(duì)照品對(duì)比確證。經(jīng)分析對(duì)照品和樣品中生物堿的質(zhì)譜裂解途徑，筆者發(fā)現(xiàn)該類生物堿支鏈易發(fā)生裂解，母核不易發(fā)生裂解。本研究以化合物A3為例詳細(xì)介紹其鑒定過程?；衔顰3的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 247.144 3[M+H]+，推測(cè)其化學(xué)式為C14H18N2O2。在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰相繼脫去1分子三甲胺、1分子CO2、1分子亞甲基分別形成碎片離子m/z 188.071 0[M+H－C3H9N]+、m/z 143.072 9[M+H－C3H9N－CO2]+和m/z 118.065 2[M+H－C3H9N－CO2－C2H3]+。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫和對(duì)照品比對(duì)，鑒定化合物A3為下箴刺桐堿，其在正離子模式下的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 正離子模式下下箴刺桐堿的質(zhì)譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑

3.4 有機(jī)酸類

在雞骨草中共鑒定出5種有機(jī)酸類成分。該類化合物的質(zhì)譜裂解特點(diǎn)為易發(fā)生CO2、H2O等中性丟失[5，7]。本研究以化合物O2為例詳細(xì)介紹其鑒定過程?；衔颫2的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 191.020 5[M－H]－，推測(cè)其化學(xué)式為C6H8O7。準(zhǔn)分子離子峰連續(xù)脫去1分子H2O、1分子CO2、1分子H2O分別形成碎片離子m/z 173.008 7[M－H－H2O]－、m/z 128.038 1[M－H－CO2－H2O]－和m/z 111.011 3[M－H－CO2－2H2O]－。此外，化合物O3的準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子峰與化合物O2相似，推測(cè)其互為同分異構(gòu)體。經(jīng)與文獻(xiàn)[16－17]和數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定化合物O2為異檸檬酸，化合物O3為檸檬酸（圖略）。

3.5 其他類

本研究在雞骨草中共鑒定出11種其他類成分，主要為蒽醌類、酰胺類化合物。以化合物G2為例介紹其鑒定過程?；衔颎2的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 268.108 5[M+H]+，推測(cè)其化學(xué)式為C10H13N5O4。準(zhǔn)分子離子峰脫去1分子核苷產(chǎn)生碎片離子m/z 136.061 8[M+HC5H8O4]+。經(jīng)與文獻(xiàn)[18]和數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定化合物G2為腺嘌呤核苷（圖略）。

4 討論

本研究基于UPLC-Q-TOF/MS獲得的高分辨前體離子信息和豐富的碎片離子信息可為雞骨草化學(xué)成分解析提供充足的數(shù)據(jù)支撐。結(jié)合UNIFI平臺(tái)，基于色譜峰提取、數(shù)據(jù)庫靶向篩選和碎片離子注釋等功能，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化學(xué)成分的快速定性分析，大大減少質(zhì)譜數(shù)據(jù)后處理的盲目性和耗時(shí)性。但本研究也存在一些方法上的不足：（1）難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體。如本研究中低能量通道質(zhì)譜圖顯示，在保留時(shí)間為9.01、9.40、10.36 min的位置均出現(xiàn)了m/z 563的色譜峰，其高能量通道質(zhì)譜圖的碎片離子也相似。采用UNIFI平臺(tái)對(duì)3個(gè)色譜峰進(jìn)行分析，UNIFI將3個(gè)色譜峰均匹配為夏佛塔苷，出現(xiàn)了假陽性結(jié)果。經(jīng)與文獻(xiàn)[8―9，20]和對(duì)照品比對(duì)，最終將這3個(gè)色譜峰依次鑒定為夏佛塔苷、維采寧-Ⅲ、異夏佛塔苷。（2）UNIFI平臺(tái)的碎片離子注釋需進(jìn)一步驗(yàn)證或修正。如化合物F6的碎片離子m/z 383.078 4，UNIFI平臺(tái)提供的碎片離子注釋為母核糖苷鍵斷裂丟失1分子六碳糖和五碳糖上的1分子H2O，而實(shí)際的斷裂是由于六碳糖和五碳糖發(fā)生糖環(huán)的交叉環(huán)切反應(yīng)[9]。當(dāng)前，UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UNIFI平臺(tái)的分析方法對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體的鑒定還需要通過與對(duì)照品、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較及疏水常數(shù)分析等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。碎片離子注釋信息對(duì)化學(xué)成分的解析提供了很大的幫助，但對(duì)于復(fù)雜的裂解，仍需要結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

綜上所述，本研究建立了UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合UNIFI平臺(tái)的分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞骨草化學(xué)成分的快速鑒定。從雞骨草中鑒定出了46種化合物，包括黃酮類化合物19個(gè)、三萜類化合物8個(gè)、生物堿類化合物3個(gè)、有機(jī)酸類化合物5個(gè)、其他類化合物11，其中11種化合物在雞骨草中首次報(bào)道，9種化合物經(jīng)過對(duì)照品比對(duì)確證。本研究初步闡明了壯藥雞骨草的主要化學(xué)成分，可為雞骨草藥效物質(zhì)及作用機(jī)制的深入研究、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供數(shù)據(jù)支撐，研究方法可為其他中藥化學(xué)成分的快速分析提供參考。