佛手蒸制前后對大鼠燥性指標及血液代謝的影響 Δ

聶沁馨 ，張秋霞 ，汪金玉 ，伍沛君 ，賀亞麗 ，林鴻彬 （.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 50006；.廣州實驗室藥物與疫苗研究部，廣州 50005）

佛手為蕓香科植物佛手Citrus medica L. var. sarco‐dactylis Swingle的干燥果實，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等疾病。《本草便讀》記載：“佛手，理氣快膈，惟肝脾氣滯者宜之，陰血不足者，亦嫌其燥耳”[1]，明確指出佛手具有燥性。燥是中藥的固有性能之一，具有治療作用與副作用。其治療作用指用于治療濕證；其副作用指根據(jù)“燥性傷陰”的中醫(yī)理論，認為燥性干澀，最易傷人津液，臨床表現(xiàn)為口干口渴、大便秘結(jié)、小便短少等癥狀[2―3]。在嶺南地區(qū)，臨床使用的佛手飲片多為蒸制后的制佛手，《廣東省中藥炮制規(guī)范》（1984年版）記載佛手的炮制作用為“蒸后降低辛燥之性”[4]。

科屬親緣關(guān)系相近的植物，常含有結(jié)構(gòu)類型相似的次生代謝產(chǎn)物。因此，研究佛手的燥性，可考慮通過參照其同科屬燥性中藥枳殼來開展。枳殼源自蕓香科柑橘屬植物，現(xiàn)代研究報道枳殼生品具有較強的燥性，會對機體的津液造成一定損傷，研究常選用飲水量、排尿量、腎水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）含量等作為枳殼的燥性評價指標[5―6]。代謝組學技術(shù)在中藥炮制相關(guān)科研中已有較為廣泛的應(yīng)用，如通過代謝組學研究何首烏“九蒸九曬”炮制后肝毒性降低的機制[7]、揭示柴胡醋制后增強保肝作用的內(nèi)在原因[8]。研究蒸制對佛手藥效的影響，可以先對比考察佛手蒸制前后對機體代謝物的影響，因為機體的許多生命活動，如能量傳遞、細胞信號釋放、細胞間通信等都會受到代謝物的調(diào)控。本研究以枳殼為陽性對照，參考枳殼的燥性評價指標，觀察佛手不同飲片對大鼠攝食量、飲水量、尿液量、AQP3等燥性指標的影響，以探究佛手致燥的特點；同時，采用代謝組學技術(shù)，尋找生、制佛手給藥干預(yù)后大鼠體內(nèi)潛在的差異代謝物及代謝通路，以期為佛手蒸制前后藥效變化研究提供科學思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有TGL-16MS型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），ACQUITY UPLC Ⅰ-Class型超高效液相色譜儀、VION IMS Q-TOF型高分辨質(zhì)譜儀（美國Waters公司），UPH型臺上式超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

生佛手飲片（批號171101）、枳殼飲片（批號170505）均購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院陳康教授鑒定為真品，分別來自蕓香科植物佛手C. medica L. var. sarcodactylis Swingle的干燥果實、蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.或其栽培變種的干燥未成熟果實。AQP3試劑盒（批號201809）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；L-2-氯苯丙氨酸購自上海恒創(chuàng)生物科技有限公司；色譜級甲醇、甲酸、乙腈均購自德國CNW公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2013-0034。所有動物均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學（大學城）實驗動物中心SPF級動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2013-0085。

2 方法

2.1 制佛手的制備

稱取生佛手飲片1 kg，淋潤蒸餾水（蒸餾水質(zhì)量為生佛手飲片質(zhì)量的20%），隔水蒸制，待圓氣后蒸制2.5 h，自然冷卻至室溫取出，于50 ℃恒溫干燥箱烘干，取出，密封保存，備用[4]。

2.2 藥液制備

取生佛手飲片50 g，分別以料液比1∶20和1∶15加入蒸餾水煎煮2次，第1次45 min，第2次30 min，合并2次煎煮液，水浴加熱濃縮至200 mL，得生佛手藥液，分裝后冷凍保存。制佛手、枳殼藥液的制備方法同上。

2.3 給藥與分組

根據(jù)2020年版《中國藥典》，佛手和枳殼每日最大用量均為10 g，根據(jù)人與動物之間藥物劑量換算關(guān)系，以成人60 kg為標準體質(zhì)量計算，大鼠每日給藥劑量約為1.2 g/kg。佛手性較溫和，在前期預(yù)實驗基礎(chǔ)上，本研究將生、制佛手的每日給藥劑量均設(shè)為正常劑量的2倍（2.4 g/kg），枳殼的每日給藥量則為正常劑量（1.2 g/kg）。

將24只大鼠隨機分為4組，分別為空白組、生佛手組、制佛手組、枳殼組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給藥組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥液（相當于生佛手2.4 g/kg、制佛手2.4 g/kg、枳殼1.2 g/kg），空白組大鼠灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)35 d。每日記錄大鼠攝食量、飲水量，分別于給藥第0、7、14、21、28、35天記錄一次體質(zhì)量并收集大鼠尿液。至第35天末次給藥后麻醉，腹主動脈取血，冷凍離心，取上層血清，保存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 大鼠血清AQP3的檢測

采用ELISA法檢測。取“2.3”項下血清樣品，以酶標儀于450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，并計算其中AQP3的含量。操作過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.5 代謝組學分析

2.5.1 代謝組學樣本制備 取“2.3”項下血清樣品，室溫下解凍后取100 μL血清，加入10 μL內(nèi)標（L-2-氯苯丙氨酸，質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，甲醇配制），渦旋振蕩10 s，再加入300 μL的蛋白沉淀劑甲醇-乙腈（2∶1，V/V），渦旋振蕩1 min，冰水浴中超聲提取10 min，－20 ℃下靜置30 min，在4 ℃條件下以13 000 r/min冷凍離心15 min，取上層清液，即得樣本提取液。質(zhì)控樣本由所有樣本的提取液取適量等體積混合制備而成。

2.5.2 色譜條件 色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，乙腈-甲醇（2∶3，V/V）溶液（含0.1%甲酸）為流動相B進行梯度洗脫（0～1 min，1%B→30%B；1～2.5 min，30%B→60%B；2.5～6.5 min，60%B→90%B；6.5～8.5 min，90%B→100%B；8.5～10.7 min，100%B；10.7～10.8 min，100%B→1%B；10.8～15 min，1%B）；流速為0.4 mL/min；柱溫為45 ℃；進樣量為1 μL。

2.5.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源在正、負離子模式下進行質(zhì)譜分析。毛細管電離電壓為2.5 kV，進樣電壓為40 V，碰撞電壓為6 eV，離子源溫度為115 ℃，氮氣溫度為450 ℃，氮氣流速為900 L/h，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 50～1 000 Da。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果滿足正態(tài)分布時以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊時）或Dunnett’s T3檢驗（方差不齊時），檢驗水準α＝0.05。選擇大鼠的血清樣本采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行分析，對檢測樣本的基峰離子流圖進行可視化檢查，將所有原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學處理軟件進行預(yù)處理，得到保留時間、m/z和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimiant analysis，OPLS-DA）。代謝物用 Progenesis QI軟件基于 HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、Lipidmaps（https：//www.lipidmaps.org/）公共數(shù)據(jù)庫及自建數(shù)據(jù)庫進行定性。根據(jù)P值和代謝物濃度的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）篩選差異代謝物，將篩選后的差異代謝物映射到KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）數(shù)據(jù)庫進行通路分析。

3 結(jié)果

3.1 藥物對大鼠體質(zhì)量、攝食量和飲水量的影響

給藥第0～35天，各組大鼠體質(zhì)量平緩上升，各組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。制佛手組大鼠的攝食量、飲水量均具有高于枳殼組和生佛手組的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠體質(zhì)量、攝食量和飲水量變化趨勢見圖1。

3.2 藥物對尿液量及血清AQP3含量的影響

給藥第7、14天，各組大鼠尿液量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥第21天，與空白組比較，枳殼組尿液量顯著降低（P＜0.05）；與枳殼組比較，制佛手組尿液量顯著升高（P＜0.05），且接近空白組。與空白組比較，各給藥組血清AQP3含量均有不同程度的升高，枳殼組血清AQP3含量較空白組顯著升高（P＜0.05）；與枳殼組比較，制佛手組血清AQP3含量顯著降低（P＜0.05），且接近空白組。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠尿液量及血清AQP3含量的測定結(jié)果（±s，n＝6）

表1 各組大鼠尿液量及血清AQP3含量的測定結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與枳殼組比較，P＜0.05

組別空白組枳殼組生佛手組制佛手組尿液量/mL給藥第7天11.67±4.23 14.22±5.13 10.93±3.09 12.15±4.46給藥第14天13.52±3.27 14.90±5.64 10.13±1.45 11.93±2.85給藥第21天14.58±5.58 9.53±3.04a 11.17±1.37 15.98±3.01b給藥第28天15.95±6.74 13.18±3.57 11.30±2.06 19.53±7.86給藥第35天15.75±6.95 12.63±4.58 11.37±2.54 17.48±8.65血清AQP3含量/（ng/mL）16.30±3.99 27.50±6.40a 22.47±1.19 17.31±3.24b

3.3 大鼠血清代謝組學分析

3.3.1 代謝輪廓分析 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對樣本進行代謝組學分析，采集正、負離子模式下質(zhì)控樣本的總離子流圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，樣品中代謝物在較短時間內(nèi)能被很好地分離。

圖2 正、負離子模式下質(zhì)控樣本的總離子流圖

3.3.2 PCA 根據(jù)PCA得分圖（圖3）可知，所有質(zhì)控樣本聚在一起，說明樣本及分析過程中儀器穩(wěn)定性良好，模型可靠，所得差異代謝物能夠反映樣本之間的生物學差異?？瞻捉M、生佛手組和制佛手組基本分離，表明生、制佛手給藥后均會影響大鼠體內(nèi)的正常代謝，且佛手炮制前后對大鼠體內(nèi)代謝的影響存在差異。

圖3 各組樣本PCA得分圖

3.3.3 OPLS-DA 3組OPLS-DA模型中，模型擬合優(yōu)度參數(shù)R2Y分別為1.000、0.991、0.829，預(yù)測優(yōu)度參數(shù)Q2分別為0.928、0.947、0.256?？瞻捉M與生佛手組、空白組與制佛手組的R2Y、Q2接近于1，說明模型有較高的解釋率及預(yù)測能力。由圖4可知，各組樣本之間分離較好，組內(nèi)樣本聚集，說明組間代謝物存在明顯差異。

圖4 各組樣本OPLS-DA模型圖

3.3.4 血清差異代謝物篩選 根據(jù)OPLS-DA模型篩選組間差異代謝物，以P＜0.05、FC＞3或FC＜1/3作為篩選條件[9]。分析得到制佛手組-空白組差異代謝物有20個，包括10個氨基酸、7個脂類、3個其他類；生佛手組-空白組差異代謝物有3個，均為脂類；生佛手組-制佛手組差異代謝物有3個，包括2個氨基酸類、1個羧酸類，結(jié)果見表2。由表2可知，生佛手給藥干預(yù)后在體內(nèi)主要影響脂類，而制佛手給藥后對脂類的影響降低，向氨基酸類遷移。

表2 大鼠血清中差異代謝物的鑒定結(jié)果

3.3.5 代謝通路分析 將差異代謝物進行匹配，得到具有KEGG信號的差異代謝物，通過KEGG pathway mapper功能進行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。篩選出P＜0.05的通路，認為該代謝通路有顯著性差異。結(jié)果顯示，生佛手和制佛手均影響了亞油酸代謝和甘油磷脂代謝。從通路P值來看，生佛手對甘油磷脂代謝的影響顯著高于制佛手，對亞油酸代謝的影響顯著低于制佛手；制佛手組-空白組和生佛手組-制佛手組的組間差異代謝物涉及多條代謝途徑，結(jié)果見表3。

表3 空白組、生佛手組和制佛手組組間差異代謝物的代謝通路

4 討論

本研究選用健康大鼠，連續(xù)給藥35 d，大鼠經(jīng)歷了藥物反應(yīng)蓄積、癥狀表現(xiàn)和機體自我調(diào)節(jié)過程。從攝食量、飲水量、尿液量3個指標的動態(tài)觀察結(jié)果可以看出，給藥7 d，生、制佛手組間3個指標都出現(xiàn)了分化；給藥第14天，兩組間攝食量和飲水量分化最大，此后分化出現(xiàn)波動。生佛手組和枳殼組大鼠飲水量較空白組和制佛手組低，然而關(guān)于枳殼燥性的文獻報道表明，生枳殼組大鼠飲水量會顯著高于空白組，文獻采用的劑量為10 g/kg[5―6]。本研究枳殼采用劑量為1.2 g/kg（正常劑量），給藥劑量不同可能是本研究中飲水量指標結(jié)果無顯著性的原因。由此也說明以飲水量作為燥性評價指標并不適合所有燥性中藥。制佛手組和枳殼組組間的尿液量于給藥第21天出現(xiàn)顯著性差異，在此前后差異均無統(tǒng)計學意義。血清AQP3在機體發(fā)揮的作用主要是促進水在細胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運，促進腎小管的重吸收[10]。有實驗證明，血清AQP3缺少小鼠會出現(xiàn)多尿癥狀[11]。本研究對大鼠血清AQP3含量的檢測結(jié)果顯示，制佛手組血清AQP3含量顯著低于生佛手組（P＜0.05）。相應(yīng)尿液量觀察結(jié)果顯示，制佛手組尿液量較生佛手組高。由此得出，AQP3含量變化可以有效反映佛手的燥性。佛手的燥可使大鼠機體內(nèi)血清AQP3含量增加，尿液量減少。綜合各項動態(tài)觀察指標和尿液量與血清AQP3的關(guān)聯(lián)性，推測研究佛手的燥性，給藥時長以21 d較為合適。綜合本研究中各項燥性相關(guān)指標的觀察/檢測結(jié)果，枳殼與佛手具有相似的燥性表征，雖然指標值的轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)時間在兩者中略有不同，但是不影響以枳殼作為佛手燥性相關(guān)研究的陽性對照藥。

代謝組學結(jié)果顯示，制佛手影響的通路涉及不飽和脂肪酸代謝、胰島素代謝、水液代謝和氨基酸代謝等。胰島素代謝、水液代謝等多個代謝中均有環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）代謝物的影響，即cAMP-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路受到影響。cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使之一，目前已被證明可以調(diào)節(jié)各種細胞進程，例如細胞代謝、增殖、凋亡和基因表達等。cAMP-PKA信號通路還可以介導(dǎo)AQPs的運輸、門控及重新分布，腺苷三磷酸在腺苷酸環(huán)化酶作用下生成cAMP，cAMP進一步激活PKA或蛋白激酶C，磷酸化活化AQPs，從而增加細胞膜對水的通透性[12]。研究證實cAMP-PKA信號通路的上調(diào)可使AQP3表達水平提高[13]。本研究代謝組學結(jié)果進一步印證血清AQP3可作為評價佛手燥性的指標之一。

生佛手組-制佛手組涉及的半胱氨酸和蛋氨酸代謝與肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。蛋氨酸又名甲硫氨酸，能促進磷脂酰膽堿合成，蛋氨酸、膽堿缺乏容易導(dǎo)致磷脂酰膽堿合成減少，造成極低密度脂蛋白的合成、分泌減少及線粒體β-氧化功能損傷，從而使三酰甘油在肝細胞中大量堆積，導(dǎo)致肝細胞脂肪變性，形成脂肪肝[14]。生佛手組-空白組和制佛手組-空白組的差異代謝物均涉及甘油磷脂代謝，且生佛手對甘油磷脂代謝的影響大于制佛手。研究表明，甘油磷脂代謝與酒精性肝損傷引起的早期脂肪變性和炎癥有關(guān)[15]，因此認為生佛手和制佛手調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用可能存在差異，后期可通過建立高脂血癥動物模型來驗證佛手炮制前后藥效變化。

綜上所述，制佛手可能通過影響cAMP-PKA通路緩和生佛手的燥性，血清AQP3含量可作為評價佛手炮制前后燥性變化的指標；生佛手和制佛手對大鼠血清內(nèi)源性代謝物的影響存在較大差異，尤其在脂質(zhì)代謝方面，可為研究佛手炮制前后藥效變化提供思路。