膽南星對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究 Δ

史叢晶 ，鄧雅方 ，張志宏 ，李彪 ，蘇慧琳 ，彭東輝 ，曾元寧 ，王秋紅 （.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣州 50006；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室/黑龍江中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點實驗室，哈爾濱 50040）

肝臟在人體代謝、解毒過程中起著舉足輕重的作用，是人體最主要的新陳代謝器官。外傷、病毒性感染、自身免疫病變或攝入某些外源性化學(xué)物質(zhì)（如藥物、毒素、酒精等）都可導(dǎo)致肝損傷，嚴(yán)重的會發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌，危害人類健康[1]。近年，中醫(yī)藥在防治肝損傷方面獲得了較大進展[2]?，F(xiàn)代研究表明，中藥可以通過抗氧化自由基損傷、減少炎癥和凋亡相關(guān)介質(zhì)的產(chǎn)生、改善肝功能、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能等途徑治療肝損傷[3]。此外，越來越多的證據(jù)表明，酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路介導(dǎo)的持續(xù)肝臟炎癥可能在肝星狀細胞激活和肝損傷形成過程中發(fā)揮重要作用[4]。

膽南星（Arisaema Cum Bile）為制天南星的細粉與牛、羊或豬的膽汁一起加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬的膽汁一起發(fā)酵加工而成[5]。其味苦、微辛，性涼，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有清熱化痰、息風(fēng)定驚的功效[6]。膽南星主要含有膽汁酸類、黃酮類、核苷類、酚類、糖類等成分[7]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，膽南星具有清熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗氧化等作用[6]，但其是否可通過抗炎、抗氧化的藥理活性發(fā)揮對急性肝損傷的保護作用卻鮮有報道。本研究以腹腔注射四氯化碳（CCl4）制備急性肝損傷小鼠模型，探究膽南星對急性肝損傷的保護作用，并基于JAK2/STAT3/NF-κB信號通路研究其可能的作用機制，為膽南星在防治化學(xué)性肝損傷方面的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有SCIENTZ-48型高通量組織研磨機（寧波新芝生物科技股份有限公司），MX-S型渦旋混合儀、D1008E型八聯(lián)管離心機（美國Scilogex公司），JY92-IIN型高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），Epoch 2型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），UVP ChemStudio/PLUS型多功能成像儀（德國Analytikjena公司），Colibri 140030型微量分光光度計（德國Berthold公司），Cycler720型PCR擴增儀（美國Thermal公司），LightCycler 96型熒光定量PCR儀（美國Roche公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

天南星飲片（批號2005001）購于亳州市悅林藥業(yè)有限公司，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定為天南星科植物天南星Arisaema erubescens （Wall.） Schott的干燥塊莖；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號RF40009，規(guī)格1.5 mg/片）購于廣州白云山星群藥業(yè)股份有限公司；CCl4購于上海麥克林生化科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate ami‐notransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dis‐mutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號分別為20210719、20210726、20210624、20210705）均購于南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleu‐kin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（批號分別為RX202412M、RX203049M）均購于泉州睿信生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝購于武漢塞維爾生物科技有限公司；RNAex Pro RNA提取試劑盒、Evo-MMLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（批號分別為A4A0413、A4A0765、A4A0500）均購于湖南艾科瑞生物工程有限公司；兔源STAT3抗體、兔源JAK2抗體、鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號分別為4729976、1372864、4718884）均購于武漢博士德生物工程有限公司；兔源NF-κB p65抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、BCA蛋白定量試劑盒（批號分別為AF0246、A0208、A0216、P0012）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏ECL發(fā)光液購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α、18S的PCR引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性C57BL/6小鼠，共50只，體質(zhì)量15～17 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（粵）2018-0002。將小鼠飼養(yǎng)于相對濕度為55%～60%、溫度為20～22 ℃、12 h黑暗/12 h光照循環(huán)的環(huán)境中。飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水和進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本實驗經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查通過，動物實驗倫理審批號為C202211-1。

2 方法

2.1 實驗藥物的制備

（1）造模藥的制備：取一定量的CCl4與橄欖油混合，用渦旋振蕩儀渦旋均勻，制備0.2%CCl4-橄欖油溶液。（2）膽南星混懸液的制備：取天南星飲片，粉碎，過八號篩。將天南星粉與牛膽汁按1∶4的質(zhì)量比混合發(fā)酵至黑色浸膏狀，干燥后即得膽南星。將膽南星粉碎，過八號篩，加0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混合溶解，備用。（3）聯(lián)苯雙酯滴丸混懸液的制備：將聯(lián)苯雙酯滴丸粉碎，加0.5%羧甲基纖維素鈉溶液混合溶解，備用。

2.2 動物分組、造模與給藥

將50只小鼠按體質(zhì)量隨機分為5組，分別為正常組、模型組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯滴丸，150 mg/kg，為成人臨床劑量的等效劑量）和膽南星低、高劑量組（0.78、2.34 g/kg，為成人臨床劑量的1、3倍等效劑量），每組10只。正常組和模型組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為10 mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃2 h后，除正常組外的其余各組小鼠均一次性腹腔注射0.2% CCl4-橄欖油溶液（劑量為10 mL/kg）復(fù)制急性肝損傷模型，正常組小鼠腹腔注射同等體積橄欖油[8]。

2.3 動物取材

小鼠腹腔注射0.2% CCl4-橄欖油溶液后，禁食不禁水。腹腔注射17 h后，稱定小鼠體質(zhì)量，并摘取小鼠眼球取血，將血液以3 000 r/min離心10 min，分離血清，于－80 ℃冰箱中凍存，備用。取血后，將小鼠脫頸椎處死，取出其肝組織，仔細觀察并拍照。稱定肝質(zhì)量，然后將一部分肝組織置于－80 ℃冰箱中凍存，另一部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 生化指標(biāo)檢測 按相應(yīng)試劑盒說明書操作檢測小鼠血清中肝功能指標(biāo)（ALT、AST）和炎癥指標(biāo)（IL-6、TNF-α）水平及小鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA、SOD）水平。

2.4.2 肝臟指數(shù)計算 通過取材前小鼠體質(zhì)量和取材后小鼠的肝質(zhì)量計算小鼠的肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)（%）＝肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.4.3 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取4%多聚甲醛固定的肝組織適量，常規(guī)制備石蠟切片，進行HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的形態(tài)變化并對肝損傷程度進行量化評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0級（0分）——正常肝組織細胞；Ⅰ級（1分）——肝細胞輕微腫脹，散發(fā)炎癥細胞浸潤，個別肝細胞壞死；Ⅱ級（2分）——肝小葉不超過1/3的局灶或斑塊性肝細胞壞死，聚集性炎癥細胞浸潤；Ⅲ級（3分）——肝小葉1/3～1/2的肝細胞壞死，大量炎癥細胞浸潤；Ⅳ級（4分）——肝小葉超過1/2的肝細胞壞死，廣泛炎癥細胞浸潤[9]。

2.4.4 肝組織中IL-6、TNF-α mRNA表達的檢測 每組隨機取3只小鼠的肝組織作為實驗樣本，采用實時熒光定量PCR法進行檢測。采用Trizol法提取肝組織中總RNA，按照Evo-M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒說明書步驟進行PCR擴增。PCR擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火/延伸30 s，共45個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系（共10 μL）如下：cDNA模板2 μL，上、下游引物各 0.3 μL，2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μL，無霉無菌水2.4 μL。以18S為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt方法計算目的基因mRNA的表達水平。

2.4.5 肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白表達的檢測 每組隨機取3只小鼠的肝組織作為實驗樣本，采用Western blot法進行檢測。采用RIPA法提取肝組織中總蛋白，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書操作檢測總蛋白濃度。將總蛋白高溫變性后，上樣（上樣量為20 μL）8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓80～110 V，時間1.5 h），然后電轉(zhuǎn)（恒流320 mA，時間3 h）至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h。以TBST洗膜3次，加入STAT3、JAK2、NF-κB p65、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶2 000），4 ℃孵育過夜；用TBST洗膜3次，加入對應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶2 000），室溫孵育1 h；用TBST洗膜3次，加入ECL顯影液進行顯影，拍照記錄。使用Vision Works軟件檢測條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；病理分級統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清中ALT、AST水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

表2 各組小鼠血清中ALT、AST水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組AST 27.87±4.52 111.45±16.17a 49.28±19.31b 62.31±15.51b 33.70±10.34b ALT 16.37±3.18 151.29±31.16a 18.70±4.31b 53.27±17.82b 18.67±4.77b

3.2 小鼠血清中IL-6、TNF-α水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）

表3 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組TNF-α 440.85±76.34 732.83±84.32a 473.17±127.50b 502.56±30.26b 414.68±46.70b IL-6 100.94±17.85 149.49±15.98a 121.77±22.81b 113.57±10.13b 89.10±5.81b

3.3 小鼠肝組織中MDA、SOD水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中MDA水平均顯著降低（P＜0.05），SOD水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠肝組織中MDA、SOD水平檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表4 各組小鼠肝組織中MDA、SOD水平檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組SOD/（U/mg）115.28±10.23 85.97±7.86a 112.96±12.34b 116.97±8.90b 113.70±6.08b MDA/（nmol/mg）0.47±0.10 2.75±1.31a 0.64±0.16b 0.81±0.12b 0.45±0.06b

3.4 小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，膽南星高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05），各給藥組小鼠肝臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表5 各組小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組肝臟指數(shù)/%4.23±0.73 5.19±0.35a 4.38±0.34b 4.58±0.31b 4.40±0.35b體質(zhì)量/g 21.55±0.78 20.48±0.77a 20.84±0.84 20.78±1.18 21.42±0.99b

3.5 小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

病理形態(tài)觀察結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織細胞排列緊密且形態(tài)正常，肝索、肝小葉、匯管區(qū)和中央靜脈周圍肝細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，無炎癥細胞浸潤和壞死細胞。模型組小鼠肝索、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂嚴(yán)重，匯管區(qū)和中央靜脈周圍的肝細胞腫脹、壞死嚴(yán)重，壞死灶相互融合形成中央靜脈-中央靜脈橋接壞死；在壞死灶中觀察到較多的炎癥細胞浸潤及碎裂溶解的細胞核；胞漿嗜酸性增強。與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織的炎癥細胞浸潤和肝細胞壞死程度均明顯降低。小鼠肝組織損傷程度評分組間比較結(jié)果如下：與正常組比較，模型組小鼠肝損傷程度評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝損傷程度評分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表6。

圖1 各組小鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

表6 各組小鼠的肝損傷程度評分結(jié)果（只，n＝10）

3.6 小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA表達水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA相對表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表7。

表7 各組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

表7 各組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組TNF-α mRNA 1.00±0.03 4.29±0.30a 2.11±0.18b 2.19±0.25b 1.39±0.15b IL-6 mRNA 1.00±0.01 4.68±0.12a 1.53±0.06b 2.14±0.42b 1.32±0.19b

3.7 小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白表達水平檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白相對表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組小鼠肝組織中JAK2蛋白相對表達水平及膽南星低、高劑量組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白相對表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表8。

表8 各組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

表8 各組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白表達水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組膽南星低劑量組膽南星高劑量組JAK2/GAPDH 0.50±0.32 0.99±0.06a 0.28±0.08b 0.31±0.18b 0.37±0.16b STAT3/GAPDH 0.67±0.17 1.54±0.33a 0.85±0.32 0.55±0.14b 0.54±0.24b NF-κB p65/GAPDH 0.49±0.15 1.91±0.13a 1.00±0.41 0.97±0.34b 0.36±0.12b

圖2 各組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白表達的電泳圖

4 討論

研究表明，炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷密切相關(guān)[10]。CCl4進入肝細胞后會使細胞膜通透性增加，引起Ca2+內(nèi)流并激活肝巨噬細胞，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，生成大量的促炎細胞因子（如TNF-α、IL-6等），導(dǎo)致肝細胞變性和壞死[11]。同時，當(dāng)CCl4進入肝細胞后會使細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成SOD水平降低、MDA水平升高，導(dǎo)致肝臟抵抗氧化損傷的能力降低，進而引起細胞腫脹、壞死，最終造成肝損傷[12]。肝細胞膜受到破壞后，肝細胞中的ALT、AST等多種酶經(jīng)肝竇間隙進入血液，血液中ALT、AST水平的升高程度代表肝細胞受損傷的程度[13]。本研究結(jié)果顯示，膽南星給藥組小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IL-6水平較模型組均顯著降低；小鼠肝組織中SOD水平較模型組顯著升高，MDA水平較模型組顯著降低。上述結(jié)果提示，膽南星對CCl4引起的急性肝損傷具有一定的保護作用，其發(fā)揮作用的方式可能有以下2種：一是通過降低炎癥細胞因子TNF-α、IL-6水平來減輕炎癥浸潤，進而減少炎癥反應(yīng)；二是通過促進細胞清除自由基來抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而降低肝細胞的損傷程度。

JAK2/STAT3信號通路是介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)及炎癥介質(zhì)傳遞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可由炎癥因子活化，進而完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[14]。IL-6作為JAK2/STAT3通路的上游啟動因子，能夠激活JAK2/STAT3通路，從而釋放更多促炎細胞因子（如TNF-α等），這些異常升高的TNF-α將進一步激活巨噬細胞和NF-κB信號通路，釋放更多的炎癥因子，加重炎癥反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果顯示，膽南星可顯著下調(diào)急性肝損傷模型小鼠肝組織中IL-6、TNF-α mRNA及JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白的表達。以上結(jié)果表明，膽南星可通過降低IL-6、TNF-α水平來抑制JAK2/STAT3/NF-κB信號通路的活化，進而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮其對肝損傷的保護作用。

綜上所述，膽南星對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制可能與抑制JAK2/STAT3/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，但其具體的作用機制還有待深入研究。