山東膠東半島產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄中酚類物質(zhì)差異性研究

程軍 李進(jìn) 周鵬輝 蹇木棟 董雅雯 王天慶 武峰 邱虎

（山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省葡萄酒工程技術(shù)研究中心，山東省企業(yè)技術(shù)中心，中糧長(zhǎng)城葡萄酒（蓬萊）有限公司，山東蓬萊 265608）

酚類物質(zhì)與植物的花瓣、葉片和果實(shí)顏色有關(guān)，是一種芳烴核(苯環(huán)或稠苯環(huán))與羥基(-OH)直接相連形成的有機(jī)化合物。植物中的酚類物質(zhì)能夠通過(guò)清除自由基，有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，同時(shí)具備明顯的抗突變、抗腫瘤、抗病毒和抗菌功效，適量的攝取能夠有效預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生。葡萄中酚類物質(zhì)含量較高，在影響葡萄植株生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)，對(duì)葡萄酒感官特性也存在較為重要的影響。這促使人們針對(duì)酚類物質(zhì)積極開(kāi)展試驗(yàn)研究，酚類物質(zhì)也成為當(dāng)前被研究最多的天然化合物之一。通過(guò)大量研究試驗(yàn)，人們目前已對(duì)酚類物質(zhì)的物理化學(xué)特性具備初步的認(rèn)知，并將其分為兩大類，分別為色素和無(wú)色多酚。其中前者被分為花色素和黃酮兩類；而后者則比較復(fù)雜，分為酚酸、聚合多酚、單寧等物質(zhì)，包含苯酸類、苯丙酸類、兒茶素、原花色素、縮合單寧、水解單寧等物質(zhì)。果皮和籽是葡萄中酚類物質(zhì)的主要分布區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，果皮中多酚以花色苷等花色素類、咖啡酸等酚酸類、槲皮素等黃酮醇類、兒茶素等黃烷醇類以及白藜蘆醇為主，而葡萄籽中則主要含有原花青素、兒茶素、槲皮素、單寧等。

大量試驗(yàn)研究表明，紅色葡萄酒中的酚類物質(zhì)一般高于白色葡萄酒；同時(shí)，由于葡萄品種、栽培條件和發(fā)酵工藝等因素都能夠?qū)ζ咸压麑?shí)中酚類物質(zhì)含量產(chǎn)生影響，使其即便在相同酒種間也可能存在較大差異。目前，人們著力探究栽培條件和發(fā)酵工藝對(duì)葡萄酒中酚類物質(zhì)的影響，但對(duì)于不同釀酒葡萄品種間酚類物質(zhì)含量差異的研究卻較少。本研究選取山東膠東半島產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭、小味兒多、小芒森、瑪爾維薩4 種釀酒葡萄品種，選取15 種單體酚作為標(biāo)樣，采用HPLC 技術(shù)對(duì)釀酒葡萄果皮和籽中酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，分析4 個(gè)品種果皮和籽中酚酸、白藜蘆醇、黃酮醇類、黃烷醇類等酚類物質(zhì)組成與含量的差異，以期為選擇適宜山東膠東半島產(chǎn)區(qū)種植的釀酒葡萄品種及相應(yīng)的栽培技術(shù)、釀造工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬瑟蘭、小味兒多、小芒森、瑪爾維薩4 種釀酒葡萄，采收時(shí)間分別為2020年10 月9 日、10 月14日、10 月26 日、10 月5 日，采自山東膠東半島產(chǎn)區(qū)，幾種葡萄原料樹(shù)齡、架勢(shì)、田園管理基本一致。

1.2 主要試劑

乙腈，色譜純；甲酸、甲醇等，均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品：咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸、香草酸、水楊酸、堪非醇、楊梅黃酮、兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Sigma 公司；蘆丁、槲皮素、兒茶素（CAT）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

1.3 主要儀器

國(guó)產(chǎn)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；國(guó)產(chǎn)水浴恒溫振蕩器；Agilent 1200 液相色譜儀。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品前處理

取-20℃冷凍的葡萄，將皮、籽、肉分開(kāi)，將皮和籽用液氮研磨，研磨后置于冰箱備用。準(zhǔn)確稱取1 g 凍干研磨后的葡萄樣品于提取液（丙酮∶水∶甲酸=80∶19∶1）中，料液比為1∶10。每種葡萄樣品的皮、籽各取3 份平行進(jìn)行提取，記錄每個(gè)平行稱取樣品的實(shí)際質(zhì)量。將提取體系水浴震蕩30 min 后，離心取上清液。將皮和籽提取液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用2 mL 色譜級(jí)甲醇重溶，存放于-20 ℃避光保存待分析。測(cè)定樣品前經(jīng)孔徑0.45/μm 濾膜過(guò)濾。

1.4.2 單體酚測(cè)定色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5μm,4.6 mm×250 mm）；紫外檢驗(yàn)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相A∶水-甲酸（98∶2）；流動(dòng)相B∶乙腈；流速：1 mL/min。

洗脫程序：0 min～7 min，B 相為5%～10%；7 min～10 min，B 相為10%～20%；10 min～15 min，B 相為20%～30%；15 min～20 min，B 相為30%～40%；20 min～30 min，B 相為40%～50%；30 min～40 min，B 相為50%～50%。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇含量差異性分析

白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，主要在虎杖、桑葚、葡萄等植物中存在。白藜蘆醇在葡萄中含量較高，是葡萄酒的重要功效成分之一。白藜蘆醇作為一種具有抗氧化效能的化合物，不僅能夠有效防止植物真菌病害感染，也能在一定程度上預(yù)防腫瘤、降低血小板聚集、治療心腦血管疾病，對(duì)人體健康具有積極的作用。

葡萄籽與果皮中白藜蘆醇含量測(cè)定結(jié)果如圖1所示。由圖1 可知，2 種紅色釀酒葡萄果皮與籽中白藜蘆醇總量在2.0 mg/kg～3.5 mg/kg 范圍，明顯高于2 種白色釀酒葡萄的0.8 mg/kg～1.0 mg/kg。同時(shí)白藜蘆醇具體分布位置差異也較大，小味兒多和小芒森籽中含量更高，分別為1.6 mg/kg 和0.7 mg/kg，果皮中含量?jī)H為0.8 mg/kg 和0.3 mg/kg；而馬瑟蘭和瑪爾維薩則是果皮中含量較高，分別達(dá)到2.4 mg/kg 和0.7 mg/kg，而果籽中則為0.7 mg/kg 和0.2 mg/kg。有研究表明，葡萄成熟轉(zhuǎn)色過(guò)程中，花色素的積累會(huì)對(duì)葡萄皮中白藜蘆醇含量造成負(fù)相關(guān)的影響。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果可知，馬瑟蘭和瑪爾維薩葡萄應(yīng)避免成熟度過(guò)高，造成果皮中白藜蘆醇的流失；而小味兒多和小芒森則相反，為使籽中合成更多的白藜蘆醇，需嚴(yán)格控制成熟度。對(duì)白藜蘆醇含量在釀酒葡萄果實(shí)不同部位的差異性研究，可為釀造過(guò)程中浸漬工藝的選擇提供參考。

圖1 葡萄籽與果皮中白藜蘆醇含量對(duì)比

2.2 酚酸類物質(zhì)含量差異性分析

酚酸類物質(zhì)作為一種小分子化合物，可與有機(jī)酸和醇類等化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，因此通常以酯類物質(zhì)的形式存在于葡萄果實(shí)中。該類物質(zhì)主要包括羥基肉桂酸類化合物和羥基苯甲酸類化合物。目前，已知在葡萄果實(shí)中含量較高的酚酸類物質(zhì)包括咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等6 種。大量研究表明，酚酸類物質(zhì)能夠?qū)χ参矬w起到重要的作用，其對(duì)于植物養(yǎng)分吸收、光合作用、酶活性等均具有一定影響。如咖啡酸，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)；香豆酸能與酒石酸結(jié)合，與葡萄酒的色度與穩(wěn)定性存在較大關(guān)聯(lián)。

葡萄皮和籽中酚酸類物質(zhì)測(cè)定結(jié)果如圖2、圖3 所示。由圖2、圖3 可知，釀酒葡萄籽中6 種酚酸類物質(zhì)總量以馬瑟蘭為最高，瑪爾維薩最低。其中，馬瑟蘭含阿魏酸量最高，達(dá)到17.3 mg/kg，含沒(méi)食子酸最低，僅有0.5 mg/kg；小味兒多中水楊酸含量最高，為12.4 mg/kg，含咖啡酸最低，僅有0.4 mg/kg；小芒森中香豆酸含量最高，達(dá)到2.3 mg/kg，含香草酸最低，僅含有0.2 mg/kg；瑪爾維薩酚酸類總含量與小芒森相差不大，但個(gè)體含量差異較大，含量最高的咖啡酸達(dá)到1.8 mg/kg，含量最低的香豆酸僅為0.2 mg/kg。而在果皮中，小味兒多酚酸類總量最高，為43.5 mg/kg；瑪爾維薩最低，為3.8 mg/kg。雖然發(fā)生了一定變化，但單體酚在品種間的差異仍較大：小味兒多中阿魏酸含量最高，達(dá)到34.9 mg/kg；馬瑟蘭中香草酸含量最高，為11.4 mg/kg；小芒森中咖啡酸含量最高，為2.0 mg/kg；瑪爾維薩中香豆酸和水楊酸含量最高，均為1.3 mg/kg。紅色釀酒葡萄品種中較高的酚酸類物質(zhì)能與花色苷、酒石酸等物質(zhì)結(jié)合，減少游離花色苷降解和酒石酸沉淀的情況，有利于增強(qiáng)葡萄酒穩(wěn)定性和陳釀潛力。

圖2 葡萄籽中酚酸類物質(zhì)含量

圖3 葡萄籽中酚酸類物質(zhì)含量

2.3 黃酮醇類物質(zhì)含量差異性分析

黃酮醇類物質(zhì)是一類獨(dú)特的黃酮化合物，主要存在于葡萄果皮中。葡萄中常見(jiàn)的黃酮醇類物質(zhì)包括槲皮素、桔皮素、山奈酚和楊梅黃酮，但這類化合物不能隨發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入葡萄酒中，因此在葡萄酒中含量并不高。黃酮醇類物質(zhì)具有消除自由基的功能，可以保護(hù)葡萄免受紫外線的傷害。

選取槲皮素、堪非醇、楊梅黃酮、蘆丁4 種黃酮醇類單體酚作為標(biāo)樣開(kāi)展試驗(yàn)研究，結(jié)果如圖4、圖5 所示。由圖4 可知，籽中黃酮醇類物質(zhì)以小味兒多含量最高，為12.8 mg/kg，另外3 個(gè)品種的含量較低，在2.0 mg/kg～4.5 mg/kg 范圍內(nèi)。小味兒多含有除槲皮素以外的3 種單體酚，其中又以蘆丁含量最高，達(dá)到10.7 mg/kg；小芒森含有除堪非醇以外的3 種單體酚，但含量普遍不高，含量最高的楊梅黃醇含量為1.8 mg/kg；馬瑟蘭和瑪爾維薩都僅含有楊梅黃醇和蘆丁2 種單體酚，其中蘆丁含量普遍更高，分別為2.7 mg/kg 和1.8 mg/kg。由圖5 可知，在果皮中，馬瑟蘭中單體酚總含量最高，小味兒多次之，小芒森和瑪爾維薩中單體酚含量則相差不大，在4.4 mg/kg～4.6 mg/kg 范圍內(nèi)。4 種釀酒葡萄果皮中都含有除堪非醇外的其他3 種單體酚，馬瑟蘭、瑪爾維薩、小芒森中含量最高的均為蘆丁，而小味兒多中則是楊梅黃酮含量最高。

圖4 葡萄籽中黃酮醇類物質(zhì)含量

圖5 葡萄皮中黃酮醇類物質(zhì)含量

2.4 黃烷醇類物質(zhì)含量差異性分析

黃烷醇類物質(zhì)包括表兒茶素（EC）、兒茶素（CAT）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）等，是葡萄果實(shí)中含量最豐富的酚類物質(zhì)之一。黃烷醇類物質(zhì)與縮合單寧的形成有關(guān)，可以為葡萄酒提供苦味和收斂性，同時(shí)也可以防止脂褐素和老年斑的形成，具有防曬美白的功效。

對(duì)EC、CAT、ECG 和EGCG 4 種黃烷醇類物質(zhì)對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果如圖6、圖7 所示。由圖6、圖7可知，與其他酚類物質(zhì)相比，黃烷醇類物質(zhì)在葡萄漿果中的總含量達(dá)到了200 mg/kg 以上，含量最高。在釀酒葡萄籽中，小味兒多中黃烷醇類物質(zhì)總含量最高，馬瑟蘭次之，含量分別達(dá)到145.1 mg/kg 和105.6 mg/kg；小芒森含量較低，為66.3 mg/kg；瑪爾維薩最低，僅含41.8 mg/kg。4 種葡萄黃烷醇類酚類物質(zhì)含量的差異可在一定程度上解釋其不同陳釀潛質(zhì)的原因，紅色釀酒葡萄品種黃烷醇類酚類物質(zhì)含量高，更適合釀造陳釀型葡萄酒；而白色釀酒葡萄品種黃烷醇類物質(zhì)含量低，更適合釀造新鮮型葡萄酒。釀酒葡萄品種，小芒森的黃烷醇類物質(zhì)含量較高，也可以用于釀造陳釀型葡萄酒。

圖6 葡萄籽中黃烷醇類物質(zhì)含量

圖7 葡萄皮中黃烷醇類物質(zhì)含量

3 結(jié)論與討論

酚類物質(zhì)是一種結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)的有機(jī)化合物，葡萄中多酚物質(zhì)對(duì)葡萄和葡萄酒的品質(zhì)有很大影響。目前有研究表明，葡萄酒的收斂性由黃烷醇類物質(zhì)控制，黃酮醇類物質(zhì)與葡萄酒的苦味有關(guān)，酚酸類物質(zhì)主要影響葡萄與葡萄酒的香氣，白藜蘆醇則是芪類物質(zhì)的主要存在形式，不但能夠抑制細(xì)菌，對(duì)降血脂也有一定功效。本研究通過(guò)對(duì)山東膠東半島產(chǎn)區(qū)4 種釀酒葡萄果皮和籽中15 種單體酚的對(duì)比測(cè)定，得出以下結(jié)論。

2 種紅色釀酒葡萄果皮與籽中白藜蘆醇總量明顯高于2 種白色釀酒葡萄。白藜蘆醇具體分布位置差異也較大，小味兒多和小芒森籽中含量更高，而馬瑟蘭和瑪爾維薩則是果皮中含量高。結(jié)合此前研究可知，馬瑟蘭和瑪爾維薩葡萄應(yīng)避免成熟度過(guò)高，造成果皮中含量較高白藜蘆醇的流失；而小味兒多和小芒森2 個(gè)品種需嚴(yán)格控制成熟度在較高水準(zhǔn)，使籽中合成更多的白藜蘆醇。

4 個(gè)品種除白藜蘆醇外的其余14 種單體酚總量以小味兒多最多，馬瑟蘭次之，小芒森再次，瑪爾維薩最低。4 個(gè)品種中，除馬瑟蘭葡萄籽中單體酚總含量略低于葡萄皮中含量外，其他品種葡萄籽中單體酚總含量均高于葡萄皮中。紅色釀酒葡萄品種籽中酚類物質(zhì)含量在140 mg/kg～190 mg/kg 范圍內(nèi)，而果皮中含量為100 mg/kg～150 mg/kg；白色釀酒葡萄品種籽中酚類物質(zhì)含量在50 mg/kg～80 mg/kg 范圍內(nèi)，而果皮中含量為30 mg/kg～50 mg/kg。

馬瑟蘭、小味兒多2 個(gè)紅色釀酒葡萄品種的酚類物質(zhì)含量均相對(duì)較高，在發(fā)酵過(guò)程中加強(qiáng)浸漬作用有助于有效提取酚類物質(zhì)。馬瑟蘭葡萄籽中單體酚總含量略低于葡萄皮中含量，釀造過(guò)程中應(yīng)同時(shí)注意加大前期浸漬和后浸漬工藝力度；而對(duì)于小味兒多品種，葡萄籽中多酚含量高于果皮，建議加強(qiáng)后浸漬工藝，以獲得葡萄籽中較高的酚類物質(zhì)，增強(qiáng)葡萄酒的陳釀潛力。小芒森果實(shí)中酚類物質(zhì)含量低于紅色釀酒葡萄品種，但仍處于較高水平，可以考慮釀造陳釀型白葡萄酒；而對(duì)于瑪爾維薩而言，其較低的酚類物質(zhì)含量決定了其更適合釀造年輕化、果香型白葡萄酒產(chǎn)品。

本試驗(yàn)對(duì)山東膠東半島產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄漿果中不同部位酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行研究，深入探究了酚類物質(zhì)的分布與差異，為產(chǎn)區(qū)內(nèi)釀酒葡萄質(zhì)量的評(píng)估以及浸漬和釀造工藝的選擇提供一定的參考。但因本試驗(yàn)選擇的單體酚并未涵蓋全部酚類物質(zhì)范圍，無(wú)法對(duì)無(wú)標(biāo)樣的酚類物質(zhì)開(kāi)展定性定量研究，因此，對(duì)葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)仍有待進(jìn)一步研究。