熒光定量PCR 檢測法在陰道加德納菌檢測中的 應用價值

林爽

細菌性陰道炎作為一種育齡女性常見疾病,與女性陰道內(nèi)的加德納菌群情況存在密切關(guān)系［1］。研究顯示,在細菌性陰道炎患者的陰道內(nèi)微生物菌群中加德納菌處于顯著優(yōu)勢地位,且高于其他正常菌群［2］,因此,陰道內(nèi)加德納菌群的科學檢測對于提高臨床治療效果具有重要現(xiàn)實意義。當前,臨床對于陰道內(nèi)加德納菌的檢查主要通過涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)線索細胞、免疫熒光檢測、細菌分離培養(yǎng)以及PCR 檢測等［3］。基于此,本次研究分別對比細菌性陰道炎女性和健康女性行熒光定量PCR 檢測加德納菌的臨床效果,分析PCR 檢測陰道內(nèi)加德納菌的診斷價值,詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2019 年1 月～2020 年12 月收治的30 例細菌性陰道炎患者作為實驗組,另選擇30 例同期健康體檢的健康女性作為對照組。實驗組年齡18～45 歲,平均年齡(33.84±5.49)歲。對照組年齡18～45 歲,平均年齡(33.92±5.45)歲。兩組年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 實驗組符合細菌性陰道炎診斷標準；對照組不存在任何陰道炎病變；兩組患者均知曉本次實驗,且自愿參與,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2.2 排除標準 研究對象存在傳染病變；凝血功能障礙；哺乳或孕期。

1.3 方法 兩組研究對象均接受熒光定量PCR 檢測法檢測,采用無菌棉拭子在女性陰道壁下1/3 處部位采集分泌物,并將其放于無菌試管內(nèi)送檢。棉拭子需在PBS 緩沖液匯總進行震蕩懸浮后對其進行離心處理,隨后收集沉淀菌體。根據(jù)提及試劑盒說明書提取細菌DNA,并放于-70℃環(huán)境中保存。加德納菌的引物合成參考文獻［3］。

定性PCR 反應體系下,保證上下游引物分別各為0.5 μl,模板設置為3 μl,使用雙蒸水補足25 μl。PCR 循環(huán)參數(shù)需設置為94℃環(huán)境下預變形5 min,94℃下進行45 s,55℃下進行45 s。將加德納菌標準菌株放置于LB培養(yǎng)基內(nèi)進行常規(guī)培養(yǎng),并選擇單個培養(yǎng)菌落,提取細菌基因組的DNA 對其進行常規(guī)的PCR 擴增處理,并使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。陽性產(chǎn)物切膠純化之后回收,并對其進行連接反應,實際操作步驟根據(jù)試劑盒說明書進行詳細操作。調(diào)節(jié)基線至合適的位置,保證各個熒光曲線與基線的交叉點作為主要的數(shù)值,并根據(jù)標準曲線上的濃度以及數(shù)值對應關(guān)系獲取各個待檢測標本的初始濃度。針對不同濃度的DNA 模板進行連續(xù)熒光定量PCR 反應,根據(jù)濃度做平行管,合理計算變異系數(shù)。

1.4 觀察指標 對比兩組定性PCR 檢測結(jié)果以及陽性率。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 定性PCR 檢測結(jié)果 實驗組標本進行實時定性PCR 檢測后PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對其進行序列分析,實驗結(jié)果與同源性對比發(fā)現(xiàn),擴增DNA 片段與序列符合率100%。

2.2 陽性率 依據(jù)Amsel 診斷標準,實驗組30 份樣本中加德納菌陽性標本數(shù)為28 份,陽性率為93.33%；對照組30 份樣本中加德納菌陽性標本數(shù)為12 份,陽性率為40.00%。實驗組加德納菌陽性率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.2000,P=0.000＜0.05)。

3 討論

陰道炎中不同的病原菌可導致不同類型的陰道炎,如滴蟲性陰道炎、細菌性陰道炎和霉菌性陰道炎［4］。滴蟲性陰道炎患者會出現(xiàn)陰道不適、疼痛瘙癢的癥狀,呈黃綠色稀薄的泡沫樣白帶。細菌性陰道炎是由陰道內(nèi)加德納菌導致的一種陰道炎癥。細菌性陰道炎作為婦科常見的疾病,其主要以女性陰道內(nèi)菌群比例失衡作為主要病變的傳染性病變［5］。細菌性陰道炎病因尚不明確,但部分學者認為是由于加德納菌與厭氧菌混合感染所致,其是該病的主要發(fā)生因素［6］?，F(xiàn)階段,臨床微生物檢查中常規(guī)的分離檢查方法是基礎(chǔ)診斷措施,應用范圍比較廣泛。傳統(tǒng)的細菌實驗室檢查以及鑒別,主要是根據(jù)細胞的組織形態(tài)性特征以及生理性狀,對細菌進行培養(yǎng)以及生化反應、免疫學檢測等［7］,檢測環(huán)節(jié)十分復雜,且無法給出理想的鑒定結(jié)果。隨著我國分子生物學的發(fā)展,PCR 技術(shù)以快速、敏感以及特異的優(yōu)勢,靈活用于微生物檢測中。

細菌性陰道炎、其他類型陰道炎以及健康女性陰道分泌物都能檢出加德納菌。研究顯示,細菌性陰道炎患者和健康女性檢查中的加德納菌檢出率存在顯著差異［8］。因此,不能單純對細菌性陰道炎女性進行PCR 檢測,還需對其進行定量研究,以此明確檢測結(jié)果,為臨床醫(yī)生提供更多的診斷數(shù)據(jù)。熒光定量PCR檢測法是一種可以進行定量檢測的基因擴增的PCR 技術(shù),此種檢測技術(shù)的住院原理是在PCR 系統(tǒng)中添加一些熒光染料或者熒光分子標記的寡核苷酸鏈,通過物質(zhì)和PCR 相結(jié)合產(chǎn)生特定的物質(zhì),且此種物質(zhì)在紫外線的刺激之下,可以發(fā)生特定的熒光。檢測人員通過觀察實驗檢測的熒光信號可以將檢測體系中相關(guān)數(shù)值顯示出來,促使檢測人員可以將檢測的基因數(shù)量拷貝出來,并根據(jù)其推理最初的基因數(shù)量。熒光標記的探針匯總主要包括水解探針和雜交探針［9］。而熒光定量PCR 檢測法中主要包括［10-12］：①絕對的定量措施,通過構(gòu)建合理的基因序列標準,并對其進行一系列的定量檢測工作,將標準品進行合理的稀釋工作之后可以獲得多個不同稀釋之后的循環(huán)閾值(Ct 值)數(shù)值。而Ct 數(shù)值也是被檢測標本熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù)量,其主要是將核算數(shù)量作為根本的橫坐標,將log(Ct)作為縱坐標進行繪制的標準曲線,其通過檢測標本的Ct 值在坐標上的位置可以基本判定檢測標本的核算數(shù)量；②相對定量：其主要是檢測人員根據(jù)公式進行推到獲得的基因,可以直接對目的基因相對管家基因的量,檢測人員不需要做一些額外的標準曲線,其具有簡便、省時等優(yōu)勢。

熒光定量PCR 檢測法還具有以下幾種檢測優(yōu)勢：檢測人員可以實時檢測檢測標本的基因擴增數(shù)量,并定量估算樣本中存在的基因初始數(shù)量,并經(jīng)過檢測中的熒光信號清晰獲取PCR 的全過程［13］。檢測人員進行的操作比較簡單,且需要消耗的檢測時間比較短,其具有較高的特異性以及靈敏度,可以顯著提升檢測的準確性［14］。檢測人員在封閉的環(huán)境中進行熒光定量PCR 實時檢測工作,可以顯著降低標本發(fā)生污染的幾率［15］。現(xiàn)如今,熒光定量PCR 已經(jīng)獲得積極普及使用,而對于mRNA 基因的表達研究、多個不同基因的定量分析、點突變的分析以及等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析以及多個微生物,都可以進行定量、定性的檢測分析工作［16］。

本次研究顯示,實驗組標本進行實時定性PCR 檢測,PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對其進行序列分析,實驗結(jié)果與同源性對比發(fā)現(xiàn),擴增DNA 片段與序列符合率100%。實驗組加德納菌陽性率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此可見,對細菌性陰道炎患者進行實時熒光定量PCR 檢測法檢測,可以靈活檢測出陰道內(nèi)的加德納菌含量,進而為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)。本次實驗通過建立實時熒光定量PCR 檢測細菌性陰道炎女性體內(nèi)的加德納菌含量,其具有靈敏度、可重復操作的優(yōu)勢,可以準確發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的加德納菌DNA 含量,幫助醫(yī)生對患者進行更好的診斷。

綜上所述,對細菌性陰道炎患者進行實施熒光定量PCR 法檢測檢測加德納菌,可以幫助醫(yī)生剛好診斷病情,提高診治效果。