陰地蕨黃酮類成分提取分離、鑒定及抗氧化活性研究進展*

李俊雅 綜述，王 姣，李 君 審校

(湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411102)

陰地蕨為陰地蕨科陰地蕨屬多年生草本植物，別稱小春花、一朵云。以全草入藥，廣泛分布于貴州、云南、湖南、湖北、廣西等地區(qū)[1-4]。陰地蕨含有總黃酮、多糖、皂苷、酚類等化學成分。黃酮類成分成為陰地蕨的主要活性成分[5]。黃酮是一類具有抗氧化活性的化合物,被認為是促進健康和預防疾病的膳食補充劑[6]。陰地蕨黃酮類成分被用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng)域[7-9]。本文通過對陰地蕨黃酮類成分的提取分離、鑒定及抗氧化活性進行綜述，研究民族醫(yī)藥資源，發(fā)現(xiàn)更多民族醫(yī)藥的藥用價值，弘揚民族醫(yī)藥事業(yè)。同時為開發(fā)陰地蕨相關(guān)藥品、食品等相關(guān)產(chǎn)業(yè)提供理論基礎(chǔ)。

1 陰地蕨黃酮的提取方法

1.1溶劑提取法 黃酮類化合物傳統(tǒng)的提取工藝多為溶劑提取法，一般多采用水或乙醇作為溶劑進行提取。水作為溶劑提取時，很容易出現(xiàn)提取物發(fā)霉變質(zhì)，一般不推薦使用。乙醇的價格相對便宜，容易回收，提取后處理方便，提取的含量高，同時不會出現(xiàn)提取液發(fā)霉變質(zhì)的問題，所以工業(yè)化大生產(chǎn)中多采用乙醇作為溶劑進行黃酮類成分的提取[10]。

鄭小衛(wèi)等[11]根據(jù)中藥提取的因素水平設(shè)計了正交試驗，對比不同濃度乙醇對總黃酮的提取效率，并最終確定陰地蕨總黃酮的提取方法為6倍量70%乙醇提取3次，每次2 h。經(jīng)過工藝驗證試驗表明：提取物中總黃酮含量達4.14 mg/g，轉(zhuǎn)移率達90%以上。

周施雨[12]采用75%乙醇作為溶劑，并采用加熱的方法開對陰地蕨總黃酮成分的提取分離，確定了提取陰地蕨黃酮的提取工藝方法。并同時對陰地蕨地上和地下部分總黃酮的含量進行了進一步的研究和探討，發(fā)現(xiàn)陰地蕨地上部分黃酮含量高于地下部分黃酮含量，為陰地蕨黃酮成分有效部位的采收確立了理論依據(jù)。

1.2超聲波輔助提取法 超聲波輔助提取法是根據(jù)空化作用在溶劑中局部形成高溫高壓，通過破壞植物的細胞，使樣品內(nèi)部變得疏松，從而增強溶劑穿透能力，提高有效成分的提取率，還可以減少實驗溶劑的消耗[13]。

曹劍鋒等[14]通過單因素試驗和正交試驗，利用超聲波輔助提取技術(shù)，以總黃酮提取率作為考察指標，把影響陰地蕨黃酮提取率的主要因素乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素作為單因素試驗對象，確定了陰地蕨中黃酮類成分的最佳提取工藝。

徐連巧等[15]和曹劍鋒等[16]以總黃酮提取率為考察指標，利用單因素試驗結(jié)合響應面Box-Benhnken試驗設(shè)計方法，考察不同影響因素對陰地蕨黃酮提取工藝的影響，確立優(yōu)化陰地蕨根黃酮提取工藝。陰地蕨粉用73%乙醇溶解后，在71 ℃超聲提取73 min，黃酮提取得率為3.429 9 mg/g。

1.3不同提取方法的比較 上述文獻中比較陰地蕨黃酮類提取工藝方法，單純采用乙醇作為溶劑得到黃酮含量較低，以乙醇為溶劑，利用超聲波輔助技術(shù)，可大大提高黃酮的提取率。結(jié)合響應面試驗設(shè)計方法，更能全面確定最佳影響因素的條件。目前,陰地蕨黃酮類成分提取工藝方法相對較少，可進一步研究微波輔助、酶輔助等方法或手段對提取工藝的影響。

2 陰地蕨黃酮的分離純化方法

2.1大孔樹脂分離法 大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，其結(jié)構(gòu)為大孔網(wǎng)狀，具有較大的比表面積，因而具有較強的吸附性和分子篩分離作用，能夠?qū)χ兴幪崛∥锏挠行С煞只蛴行Р课贿M行提取分離，是20世紀發(fā)展起來的新型有機高聚物吸附劑，常用于中藥有效成分的分離[17]。

鄭小衛(wèi)等[11]以陰地蕨總黃酮為指標，對陰地蕨黃酮的吸附能力和解吸附能力作為考察對象，優(yōu)選不同型號大孔吸附樹脂確定陰地蕨黃酮類成分的分離工藝。從樣品pH值、樣品液濃度、洗脫液用量和洗脫液濃度等影響陰地蕨黃酮類成分分離的主要因素采用單因素比較法，建立了陰地蕨總黃酮的大孔樹脂分離工藝，獲得了較高的黃酮回收率。當上樣液pH值為5、濃度為1.22 mg/mL時吸附量最大，洗脫劑70%乙醇時得率最高，達75%以上。

2.2聚酰胺樹脂分離法 鄭小衛(wèi)等[11]對2種聚酰胺樹脂進行了靜態(tài)吸附量與解吸附率的考察，結(jié)果表明,100-200型聚酰胺樹脂對小春花黃酮的吸附和解吸附率優(yōu)于60～80型聚酰胺樹脂。陰地蕨總黃酮的聚酰胺樹脂分離工藝為樣品液濃度為1.18 mg/mL，用70%乙醇4BV洗脫，總黃酮得率為76.69%。

2.3柱色譜分離法 羊波等[18]利用反相硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠柱色譜法等方法對陰地蕨進行分離純化，共分離出陰地蕨醋酸乙酯部位分離得到10個黃酮類化合物，并通過理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

2.4高速逆流色譜分離技術(shù)(HSCCC) HSCCC是一種不用任何固態(tài)載體或支撐體的液液分配色譜技術(shù)。其分離原理為兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，通過兩相溶劑連續(xù)有序的重復混合實現(xiàn)高效分離，是近幾年發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)[19-20]。

吳大同等[21]研究認為，黃酮化合物的分配系數(shù)會隨著酸度的變化而變化。根據(jù)此原理，構(gòu)建了動態(tài)可變pH高速逆流色譜，并將其用于陰地蕨提取物的分離純化。以三元溶劑(正丁醇、乙酸乙酯、水)組成兩相溶劑體系，前80 min以硫酸銨為流動相，80 min后加入一定量的醋酸為流動相。最終分離提純了陰地蕨中5種黃酮糖苷類化合物，并獲得了較好的得率。

2.5不同分離方法的比較 柱色譜分離方法需要反復上柱，實際操作過程繁瑣，多適合實驗室研究，工業(yè)化大生產(chǎn)不太適應。高速逆流色譜適應性好、回收率高、分離效率高，可用于天然藥物中有效成分的分離。但目前的HSCCC不夠成熟穩(wěn)定，較佳的溶劑系統(tǒng)需要多次實驗才能篩選出來。HSCCC發(fā)展成為一種更加成熟的可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)需要進一步更多的穩(wěn)定性試驗研究。大孔樹脂技術(shù)可以提高黃酮類化合物得率和純度。目前，對于陰地蕨黃酮成分的分離應用廣泛，可作為目前陰地蕨黃酮類成分首選的分離技術(shù)。

3 陰地蕨黃酮的鑒定方法

陰地蕨已有的研究報道表明,陰地蕨黃酮類成分主要為槲皮素、木犀草素、山奈酚等[22-24]。

3.1紫外分光光度法 紫外分光光度法具有操作簡單、儀器費用少、分析速度快，靈敏度高等特點，常作為藥品鑒別的方法。

辛文秀等[25]利用黃酮類成分在堿性條件下能與硝酸鋁形成紅色螯合物的特性，以槲皮素為對照品，于507 nm下測定吸光度值，從而計算總黃酮的含量。方法學研究結(jié)果顯示，槲皮素濃度在30.23～181.40 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.998 4)，并且具有很好的準確性、精密度及穩(wěn)定性，適用于陰地蕨總黃酮的含量測定。

3.2薄層色譜法 陳敏等[26]建立了陰地蕨制劑小春花口服液中黃酮類主要有效成分木犀草素的定性鑒別方法，以硅膠G-0.5%CMC-Na板作為固定相，以苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)作為展開劑。陰地蕨制劑中與木犀草素對照品對應位置處呈較明顯的暗斑，表明供試品中含木犀草素。

3.3高效液相色譜法 陳敏等[26]建立了高效液相色譜法測定陰地蕨制劑小春花口服液中木犀草素含量，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑作為固定性；用0.4%磷酸緩沖液(pH=3)-甲醇(50∶50)組成流動相，355 nm確定紫外檢測波長。結(jié)果小春花口服液中主要陰地蕨黃酮有效成分保留時間為15 min，并與供試品中其他成分色譜蜂較好分離。該質(zhì)量標準方法的確立，也為陰地蕨制劑小春花口服液中主要成分的質(zhì)量評價提供了依據(jù)。

辛文秀等[25]研究發(fā)現(xiàn)，陰地蕨中黃酮類成分主要是槲皮素和山奈酚，并以此成分作為陰地蕨藥材的質(zhì)量控制含量測定的指標。建立了高效液相色譜法同時測定陰地蕨藥材中槲皮素和山奈酚含量的方法。采用YMC ODS柱色譜柱，甲醇-0.4%磷酸(52∶48)為流動相，檢測波長用為360 nm，采用二極管陣列檢測器，在此色譜條件下陰地蕨黃酮類主成分槲皮素、山奈酚色譜峰峰形好、分離度高。理論塔板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5。

本課題前期研究[27]建立了高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地、不同采收期、不同部位陰地蕨藥材中木犀草素的含量。同時研究發(fā)現(xiàn)陰地蕨黃酮類成分木犀草素的含量每年8月份藥材各部位含量最高；不同部位木犀草素的含量由高到低的順序為：葉、莖、根；每年不同生長時期、不同部位呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。為陰地蕨生物特性的形成及陰地蕨藥材采收期提供一定的科學依據(jù)。

3.4聯(lián)用技術(shù) 何可群[28]通過高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)法，通過獲得分子量信息,鑒定陰地蕨中山奈酚成分，然后進一步與標準樣品保留時間對比，確定陰地蕨中山奈酚及槲皮素成分。高效液相色譜儀采用Agilent1200LC及質(zhì)譜儀為API3200 QTRAP MS/MS，色譜柱為Eeilipse plus C18色譜柱，流動相采用甲醇-0.4%甲酸溶液(45∶55)，檢測波長為360 nm鑒定陰地蕨中黃酮類有效成分。樣品中特征峰m/z301.0[M+H]+峰及m/z287.1[M+H]+，與槲皮素及山奈酚對照品特征峰具有高度相似度，證實陰地蕨中含有豐富的槲皮素和山奈酚成分。

3.5不同鑒定方法的比較 隨著陰地蕨藥材資源開發(fā)和研究，陰地蕨成分的檢測和鑒定方法已從早期的紫外分光光度法、薄層色譜法，發(fā)展到目前廣泛使用的液相色譜法，以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。其測定成分也已從總成分總黃酮到具體成分木犀草素、槲皮素、山奈酚等的研究。分離、鑒定出陰地蕨總黃酮更多的成分，對于陰地蕨藥材資源開發(fā)，發(fā)現(xiàn)研究陰地蕨更多的藥效成分和生物學作用及建立與藥效相關(guān)的質(zhì)量控制標準具有重要意義。

4 陰地蕨黃酮類抗氧化活性研究

4.1直接清除活性氧自由基 黎遠軍等[30]利用消除DPPH、ABTS自由基的能力和還原能力作為測定指標測定了陰地蕨的乙醇提取物總黃酮類成分的抗氧化活性。結(jié)果表明，陰地蕨總黃酮能直接消除DPPH、ABTS產(chǎn)生的自由基，有較強的抗氧化能力。且陰地蕨抗氧化活性與總黃酮含量存在濃度依賴。

曹劍鋒等[14]考察了陰地蕨黃酮提取液對羥基自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力，研究陰地蕨黃酮成分的抗氧化作用，并通過單因素正交試驗確立了陰地蕨抗氧化活性成分的最佳提取工藝。結(jié)果表明陰地蕨根總黃酮提取液具有清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的作用，證實陰地蕨黃酮具有明顯的抗氧化活性。并進一步試驗研究發(fā)現(xiàn)陰地蕨根中黃酮成分抗氧化活性成分較高，陰地蕨根中的黃酮成分是一種良好的抗氧化成分。

4.2抑制油脂過氧化反應 徐連巧等[15]和曹劍鋒等[16]以過氧化值(POV)為指標，采用Schaal烘箱法研究了陰地蕨總黃酮對油脂的抗氧化性能。結(jié)果表明，油脂自氧化反應程度隨烘箱放置時間的延長而加大，在相同的烘箱放置時間段，植物油的POV遠比動物油的POV大，表明植物油受到相同烘箱熱能時更容易發(fā)生自氧化反應。陰地蕨黃酮提取液可以不同程度地降低動物油和植物油的過氧化值。證實陰地蕨總黃酮對動物油和植物油均有優(yōu)良的抗氧化效果，陰地蕨黃酮提取液對動物油抗氧化作用更為顯著，并且其抗氧化作用效果呈劑量相關(guān)性。陰地蕨抑制油脂抗氧化反應的特點，適合作為高溫烘焙油炸食品類的抗氧化添加劑。

4.3增強抗氧化酶的活性 人類老齡化相關(guān)影響因素研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的過氧化物尤其過氧化陰離子自由基，因為不及時清除積聚體內(nèi)會成為人體的“垃圾”，甚至會直接攻擊殺害人體重要的蛋白質(zhì)、核酸和內(nèi)臟器官，導致機體實質(zhì)性組織器官損傷破壞。因此，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)顯得非常重要。人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等一系列酶組成。

其中SOD是人體內(nèi)的一種最重要的細胞保護酶，能有效地抵抗過氧化陰離子自由基的功能。SOD作為細胞保護酶的原理是，其能促使氧自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫，從而清除炎癥過程中伴隨產(chǎn)生的過氧化物游離基，保護細胞的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。因此，SOD酶活性的強弱常作為抗氧化能力的關(guān)鍵評價指標。GSH-Px是機體內(nèi)一種過氧化物分解酶，能迅速促進過氧化氫的分解，消除過氧化氫，在機體氧化和抗氧化平衡中發(fā)揮作用。體外加入外源性抗氧化劑可以提高機體抗氧化酶的活性，間接增強對過氧化陰離子自由基的清除作用，從而抵抗氧化損傷。近年來，已有大量關(guān)于中藥增強抗氧化酶活性的相關(guān)研究報道。

黎遠軍等[30]參照大鼠訓練方案，對運動組和運動加藥組大鼠先在跑臺進行適應性訓練，研究了陰地蕨提取物對運動訓練大鼠腎臟氧化酶活性的影響，實驗結(jié)果顯示，運動組大鼠經(jīng)過了長時間較大強度的運動后，腎臟組織SOD活性降低，運動加藥組大鼠SOD和GSH-Px活性比單純運動組升高，證實陰地蕨提取物能提高抗氧化酶的抗氧化作用，陰地蕨提取物所含抗氧化劑能保護抗氧化酶的結(jié)構(gòu)不受破壞，陰地蕨提取物對大鼠腎臟組織具有一定的抗氧化能力，能減輕機體氧化損傷程度，維護機體組織正常的結(jié)構(gòu)、生理功能和運動功能。

周云等[31]研究發(fā)現(xiàn)，陰地蕨提取物提高了小鼠的力竭運動時間，緩解了小鼠運動后的疲勞感，增強了運動后小鼠體內(nèi)的SOD活力，證明陰地蕨具有一定的抗氧化能力。為陰地蕨藥用價值的開發(fā)提供了有力保障。

陰地蕨黃酮作為抗氧化活性物質(zhì)，具有良好的抗氧化陰離子能力，將其抗氧化活性物質(zhì)研究利用，開發(fā)新的食品藥品抗氧化劑，對于食品藥品添加劑、健康追求具有重要意義。對于陰地蕨中的抗氧化活性物質(zhì)，目前對其研究主要集中在總成分的提取、生物活性考察等方面，還需進一步深入研究單一成分抗氧化活性能力及作用機制和代謝機制研究。

5 結(jié)語與展望

本文介紹了陰地蕨黃酮的提取分離、鑒定及抗氧化活性的研究進展。為陰地蕨藥用價值的開發(fā)提供了有力保障，同時也為開發(fā)治療以抗氧化機制為病基的疾病及成方制劑提供依據(jù)。

陰地蕨作為我國少數(shù)民族地區(qū)的民間藥，我國的民族藥，近幾年，對于陰地蕨黃酮成分提取分離的研究取得了一定的進展，但適合工業(yè)化大生產(chǎn)的提取工藝尚需進一步深入研究。陰地蕨黃酮類成分抗氧化活性的實驗室研究較多，但開發(fā)出來具有抗氧化活性的陰地蕨制劑較少。對于陰地蕨資源的開發(fā)還有很大的發(fā)展空間，未來將進一步研究陰地蕨成分及制劑在醫(yī)藥、食品、化妝品等各領(lǐng)域的價值。