基于文獻數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學的中藥治療胰島素抵抗的作用機制研究

李風雷，韓紫陽，朱杰

（1.南京中醫(yī)藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300；2.泰州市城西街道衛(wèi)生服務中心，江蘇 泰州 225300；3.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，江蘇 南京 210046；4.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)技術學院，江蘇 南京 210029）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）作為代謝功能紊亂的表現(xiàn)之一[1]，在早期糖尿病[2]、多囊卵巢綜合征[3]、非酒精性脂肪肝[4]等多種代謝性疾病中有重要作用，同時也與神經(jīng)功能受損等問題密切相關[5，6]。近年來，胰島素抵抗患者人數(shù)在世界范圍內迅速增加[7]，但胰島素抵抗具體的作用機制尚不明確。Onyango AN[8]將胰島素抵抗?jié)撛诘臋C制歸結為在多種因素誘導下的細胞應激（氧化應激、內質網(wǎng)應激、遺傳毒性應激等）、應激反應（蛋白質反應、DNA 損傷反應、細胞凋亡、炎癥反應等）和應激反應網(wǎng)絡（自噬、抗氧化等）共同作用于肝臟、骨骼肌、脂肪等胰島素靶細胞從而達到抑制胰島素信號傳導的作用。目前，西醫(yī)對于胰島素抵抗的治療以二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物為主，但易出現(xiàn)不耐受、水鈉潴留與體重增加等副作用[9]。而中醫(yī)藥具有多角度、多靶點、副作用較小等優(yōu)勢，對胰島素抵抗的治療具有明顯的優(yōu)勢[10]，因此，從中醫(yī)藥的角度尋找潛在的高效治療胰島素抵抗的作用機制成為迫在眉睫的問題。網(wǎng)絡藥理學可通過構建藥物-靶點-疾病調控網(wǎng)絡探究疾病潛在的作用機制[11]。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘的方式，統(tǒng)計整理中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫內中醫(yī)治療胰島素抵抗的方藥，獲得中藥治療胰島素抵抗用藥規(guī)律與常用藥對，并研究中藥治療胰島素抵抗核心藥對的成分和靶點，探討其治療胰島素抵抗的作用機制，為中醫(yī)治療胰島素抵抗提供更多的理論基礎和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源 以“中藥”“胰島素抵抗”為關鍵詞，檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)（Wanfang Database）、維普數(shù)據(jù)庫（CSTJ）內中藥治療胰島素抵抗的相關文獻。檢索時間為1990 年1 月1 日-2022 年3 月29 日，對文獻進行整理歸納。

1.2 納入和排除標準 納入標準：①樣本量≥10；②中藥復方治療胰島素抵抗的臨床研究文獻；③文獻中胰島素抵抗患者的診斷標準明確；④文獻中有完整的方藥；⑤胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=患者空腹血糖（FPG）×空腹血漿胰島素（FINS）/22.5≥2.8[14]。排除標準：①中藥復方治療胰島素抵抗的臨床療效不明確；②重復方藥；③綜述與基礎實驗類文獻；④文獻中無治療胰島素抵抗的完整方藥。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫的建立 通過在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫篩選后共獲得307 篇中藥治療胰島素抵抗相關文獻，共涉及270 種中藥。將納入文獻中涉及中藥復方的具體中藥名稱錄入Excel 并構建有效數(shù)據(jù)庫。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫的規(guī)范 按照納入及排除標準對數(shù)據(jù)庫進行整理篩選，并參照《中華人民國共和國藥典》（2020 年版）對文獻中的中藥名進行統(tǒng)一規(guī)范，如“山萸肉”改為“山茱萸”“炒白芍”改為“麩炒白芍”等。

1.4 數(shù)據(jù)分析 將獲取的307 個方藥中的中藥進行頻次統(tǒng)計并構建關聯(lián)矩陣，通過SPSS Molder 18.0軟件，設置最大鏈接數(shù)為80，強鏈接下限為35，構建關聯(lián)矩陣網(wǎng)絡，再選取兩藥組合藥對鏈接≥6 的藥物，導入cytoscape 進行可視化分析。采用Apriori進行建模，設置最小規(guī)則置信度為70%，最小條件支持度為10，最大前項數(shù)為2。最后，運用SPSS 軟件對頻數(shù)＞30 的中藥進行聚類分析，度量標準為Pearson 相關性。

1.5 中藥核心藥對的網(wǎng)絡藥理學分析 將文獻數(shù)據(jù)挖掘獲得的中藥治療胰島素抵抗的核心藥對成分分別導入TCMSP，設置口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，篩選后得到核心藥對的中藥成份靶點及目標靶點。通過關鍵詞“insulin resistance”檢索GeneCards、OMIM、Pharmgkb、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫得到疾病作用的靶點，并繪制疾病與藥物相關的靶基因的Venn 圖。然后，將疾病與藥物相關靶基因導入Cytoscapes 并構建中藥調控網(wǎng)絡；將藥對與疾病相關靶點導入String，選擇“Homo Sapiens”，構建蛋白互作網(wǎng)絡。最后，利用Metascape，選擇“H.sapiens”并進行個性化分析可獲得核心藥對的GO 和KEGG 富集分析并利用KEGG 網(wǎng)站獲取KEGG 通路圖。

2 結果

2.1 單味中藥使用頻數(shù)統(tǒng)計 共獲取文獻307 篇（知網(wǎng)230 篇，維普19 篇，萬方58 篇），涉及270種不同中藥，中藥總頻次為3095 次。其中頻次＞30的單位中藥共有27 種，見表1。其中頻數(shù)較高的有黃芪（163 次）、丹參（127 次）、茯苓（116 次）和黃連（101 次）。

表1 高頻單味中藥治療胰島素抵抗的頻數(shù)分布（頻數(shù)＞30）

2.2 單味中藥使用情況的聚類分析 利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析，見圖1。高頻藥物主要可分為4 大類。第一類中藥的主要作用為補腎益氣，組成包括山茱萸、熟地黃、山藥、枸杞子、丹參、葛根、黃芪、淫羊藿和菟絲子，第二類中藥主要具有活血化瘀、補益氣血的功效，組成包括當歸、川芎、赤芍、桃仁和甘草，其組合與中醫(yī)養(yǎng)血祛瘀復方“生化湯”加減方關系密切，第三類中藥主要具有補氣健脾的功效，其組成有柴胡、白芍、澤瀉、山楂、蒼術、陳皮、白術、黨參和茯苓，第四類為清熱補陰藥，中藥主要有黃連、知母、地黃和麥冬。

圖1 單味中藥使用情況的聚類分析

2.3 兩藥組合關聯(lián)共現(xiàn)網(wǎng)絡可視化 兩藥組合藥對（鏈接≥6）共602 組，涉及85 種不同的中藥，通過cytoscape 軟件進行可視化網(wǎng)絡，見圖2。其中顏色越深表示鏈接越多，顏色越淺表示鏈接越少。鏈接較強的藥對有黃芪-丹參（76 條）、黃芪-山藥（56 條）、黃芪-茯苓（55 條）、黃芪-葛根（51 條）、丹參-茯苓（51條）和茯苓-白術（57 條）。

圖2 兩藥組合關聯(lián)共現(xiàn)網(wǎng)絡可視化

2.4 中藥復方治療胰島素抵抗關聯(lián)規(guī)則分析 運用SPSS Modeler 18.0 軟件和Apriori 算法進行關聯(lián)規(guī)則分析，選擇最小規(guī)則置信度為70%，最低條件支持度≥10%，最大前項數(shù)為2，提升度≥1，按置信度的大小，共獲得8 個藥對，其中黃芪-山藥-丹參藥對為置信度關聯(lián)性最強的藥對，為網(wǎng)絡藥理學和分子對接做準備，見表2。

表2 中藥復方治療胰島素抵抗的關聯(lián)規(guī)則

2.5 基于網(wǎng)絡藥理學分析黃芪-山藥-丹參藥對治療胰島素抵抗的作用機制 黃芪-山藥-丹參藥對為置信度關聯(lián)性最強藥對且提升度＞1，可以作為治療胰島素抵抗的核心藥對。通過TCMSP 網(wǎng)站篩選并獲取黃芪、山藥、丹參的有效活性成份101 個，并進一步獲取其目標靶點。

2.5.1 黃芪-山藥-丹參藥對治療胰島素抵抗的相關作用靶點 黃芪-山藥-丹參藥對治療胰島素抵抗的相關作用靶點見圖3，左側為藥對相關靶點，共有226 個，右側為疾病相關靶點，共有5029 個，取兩者交集共獲得203 個黃芪-山藥-丹參藥對治療胰島素抵抗的相關作用靶點。

圖3 黃芪-山藥-丹參藥對與胰島素抵抗共同作用相關靶點

2.5.2 GO 與KEGG 富集分析 通過Metascapes 和KEGG 網(wǎng)站對目標蛋白進行GO 與KEGG 富集分析，見圖4、圖5。GO 富集分析顯示，生物學過程（BP）中富集度較高的有對無機物的反應（response to inorganic substance）為47.6，對有毒物質的反應（response to toxic substance）為44.0，對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）為39.4。細胞成分（CC）中富集度較高的有膜筏（membrane raft）為22.5，受體復合體（receptor complex）為11；分子功能（MF）中富集度較高的有轉錄因子結合（transcription factor binding）為21.4，核受體活性（nuclear receptor activity）為19.8，蛋白激酶結合（protein kinase binding）為17.8。KEGG 富集分析結果顯示，X 軸為rich factor 即富集到目標通路基因數(shù)占比rich factor越大，表示富集的程度越大，Y 軸為富集程度較高的通路，P-value 越大則富集越明顯，rich factor 最高的通路為AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 信號通路。

圖4 GO 富集分析圖

圖5 KEGG 富集分析圖

2.5.3 分子對接 基于PPI 網(wǎng)絡分析獲得黃芪-山藥-丹參的核心成分為木犀草素、槲皮素、山奈酚，其分別與治療的核心靶點JUN、STAT3、MAPK1 進行分子對接，見表3。其中分別與槲皮素、木犀草素、山奈酚、結合最穩(wěn)定的靶點為JUN、MAPK1、JUN。STAT3與、槲皮素結合最穩(wěn)定，結合能為-8.2 kcal/mol，見圖6～圖9。

圖6 槲皮素與JUN

表3 黃芪-山藥-丹參主要成分與治療胰島素抵抗核心藥對的分子對接最低結合能（kcal/mol）

圖7 木犀草素與MAPK1

圖8 山奈酚與JUN

圖9 槲皮素與STAT3

3 討論

胰島素抵抗在中醫(yī)并無明確的病名，目前中醫(yī)對胰島素抵抗的治療主要是根據(jù)其伴隨病證進行辨證論治。治療胰島素抵抗以補益脾腎，活血化痰為主。國醫(yī)大師周仲瑛教授基于多年臨床經(jīng)驗提出“瘀熱論”的學術思想[13]，胰島素抵抗為氣虛血瘀日久，郁而化熱，瘀熱搏結，故治療胰島素抵抗也可以兼以清熱活血。本文通過數(shù)據(jù)挖掘，獲得四大類（補腎益氣、活血化瘀、補氣健脾及補陰清熱）治療胰島素抵抗的高頻中藥以補為主，疾病以虛為本與上述臨床觀察結果較為一致。

黃芪-山藥-丹參作為治療胰島素抵抗的核心藥對，其相關靶點共有226 種。黃芪，性味甘，微溫，具有補氣、抗炎、調節(jié)糖脂代謝的功效[14]；山藥，性味甘，具有健脾化濕，培補脾腎，降血糖，調節(jié)胰島功能的作用[15]；丹參，性味苦，微寒，基于“瘀熱論”的學術思想，活血化瘀，清熱除煩[16]。黃芪-山藥-丹參藥對主要通過補氣健脾，祛濕活血，標本兼治，達到治療胰島素抵抗的功效。本研究通過TCMSP 網(wǎng)站和中藥調控網(wǎng)絡獲得黃芪-山藥-丹參治療胰島素抵抗關聯(lián)性較強的藥物活性成份有槲皮素、木犀草素、山奈酚。槲皮素、木犀草素、山奈酚都屬于黃酮類化合物，是具有抗氧化特性的重要化合物群，可以清除ROS、誘導抗致病性活動，抑制脂質過氧化[17]。此外，實驗研究表明[18]，槲皮素通過增加SIRT1 的表達，激活AKT 信號通路，從而調節(jié)脂代謝和葡萄糖水平。Wang S等[19]通過測量實驗小鼠的炎癥細胞，證實了木犀草素具有抗炎、抗過敏、調節(jié)細胞自噬與免疫力的功效?，F(xiàn)代研究表明[20]，木犀草素具有雙向調節(jié)的功效，既可以抗細胞的凋亡[21]，也可以促進細胞的凋亡[12]，從而達到治療疾病的作用。山奈酚除了可以抗炎外[22]，與木犀草素共同使用還可以增強對藥物代謝酶表達[23]。總之，黃芪-山藥-丹參藥對是高效防治胰島素抵抗及其伴隨病癥的潛在核心組成并通過相關現(xiàn)代研究進一步得到證實。

基于PPI 蛋白互作網(wǎng)絡可以獲得治療胰島素抵抗的核心基因共有203 個，篩選后degree 分數(shù)較高的基因有 STAT3（degree27）、JUN（degree27）、MAPK1（degree26）、TP53（degree25）。STAT3 作為一種信號傳導和轉錄激活因子，是炎癥細胞的IL-6的下游效應子，與炎癥反應關系密切[24]。實驗研究表明[25]，在T 細胞中STAT3 促進脂肪組織炎癥，進而調節(jié)由慢性炎癥引起的胰島素抵抗。Li H等[26]證實了抑制STAT3 可以有效防止過量氨基酸引起的肝胰島素抵抗。此外，研究進一步證實STAT3 受槲皮素調控促進自噬、改善了炎癥反應[27，28]。MAPK1（ERK1）一種細胞外信號調節(jié)激酶，受木犀草素調控不僅參與抗炎、抗腫瘤和軟骨細胞受體[29]，而且與胰島素的敏感性和抵抗力相關[30，31]。JUN（AP-1）作為一種轉錄因子，參與了細胞增殖、凋亡等多種細胞過程[32]。實驗結果顯示[33]，槲皮素通過調控JUN 蛋白還可以促進脂質抗氧化能力。Higa JK等[34]研究結果顯示，抑制AP-1 的活化有助于緩解由脂毒性引起的IL-6 過度生產(chǎn)，減輕炎癥反應。腫瘤蛋白TP53 調控的代謝性活動可分為抑制腫瘤和中和胰島素，是代謝平衡的重要調節(jié)器[35]。TP53 在肝臟、脂肪組織、骨骼肌肉等多種組織中參與胰島素抵抗的形成。基于GO 和KEGG 富集分析，篩選出黃芪-山藥-丹參藥對治療胰島素抵抗富集程度前20 條通路，其中富集程度最大的通路為糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號通路，其次為前列腺癌信號通路、鉑耐藥信號通路、血管內皮生長因子信號通路、利什曼病信號通路、乙型肝炎信號通路、催乳素信號通路等，可大致分為疾病相關通路（內分泌代謝、癌癥相關通路）、細胞與環(huán)境處理相關通路（細胞衰老與信息傳導通路），富集顯著性最高的通路為癌癥通路。此外，在ACERAGE 信號通路中可以同時富集到JUN、MAPK1、STAT3、AP-1 這四個核心基因，主要涉及MAPK 信號通路結合轉錄因子調控炎癥導致的胰島素抵抗。

綜上所述，中藥治療胰島素抵抗可分為補腎益氣、活血化瘀、補氣健脾、補陰清熱藥四大類。中醫(yī)治療的核心藥對有黃芪-山藥-丹參，其主要成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚，可以從抗氧化應激、抗炎、抗細胞凋亡和促進細胞自噬等細胞應激、應激反應、應激反應網(wǎng)絡多較角度治療胰島素抵抗，相較于西藥的單一角度治療更具有全面性。其中，槲皮素主要作用于靶點JUN、STAT3，木犀草素作用于MAPK2靶點，通過對無機物、有毒物質、脂多糖反應等生物學過程，與轉錄因子、蛋白激酶結合達到抑制胰島素抵抗的作用是槲皮素治療胰島素抵抗的潛在作用機制之一，后續(xù)可以通過結合臨床與科研實踐對研究結果加以驗證，為今后中醫(yī)高效地治療胰島素抵抗提供更多的理論基礎和依據(jù)。