-80℃冰箱長(zhǎng)期凍存外周血造血干細(xì)胞研究

陸紫敏，鄭偉萍，丁 懿，紀(jì)黎明，方 琦，孫向華

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院輸血科，上海 200065;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065;3.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液科，上海 200065;4.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200065)

外周血造血干細(xì)胞移植(peripheral blood stem cells transplantation，PBSCT)是治療難治復(fù)發(fā)白血病、惡性淋巴瘤及骨髓瘤患者、實(shí)體腫瘤等疾病有效方法之一。而保存采集的造血干細(xì)胞活力是PBSCT技術(shù)成功關(guān)鍵技術(shù)之一。其中以10%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)保護(hù)劑在－196℃液氮中保存細(xì)胞是經(jīng)典長(zhǎng)期保存方法，但因其操作復(fù)雜性在臨床應(yīng)用受到一定的限制。同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院自2007年1月至2013年1月對(duì)45份采集凍存的外周血造血干細(xì)胞(peripheral blood stem cell，PBSC)進(jìn)行－196℃的液氮和－80℃低溫冰箱凍存研究，旨在評(píng)價(jià)外周血造血干細(xì)胞在－80℃低溫冰箱中長(zhǎng)期凍存的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MCS+血細(xì)胞分離機(jī)購(gòu)自美國(guó)血液技術(shù)公司;－80℃低溫冰箱購(gòu)自日本三洋公司;液氮罐購(gòu)自上海五鋼氣體有限責(zé)任公司;XS-800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購(gòu)自日本Sysmex公司;EPICS XL-II流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Coulter公司;低溫保存血袋購(gòu)自美國(guó)Baxter公司。

DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎盼藍(lán)購(gòu)自上海試劑三廠;RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CD34單抗購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 標(biāo)本來(lái)源

外周血造血干細(xì)胞(peripheral blood stem cell，PBSC)來(lái)自于同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院2007年1月至2013年1月不同病種行自體造血干細(xì)胞移植患者及患者同胞干細(xì)胞捐獻(xiàn)者共30例，每例采集PBSC為1～2次。需要凍存PBSC共有45份(袋)。所有入組PBSC均由MCS+血細(xì)胞分離機(jī)采集，每袋采集的干細(xì)胞總量在75～150 ml間，采集前均使用重組集落刺激因子300 μg/d，皮下注射4～5 d。男21例，女9例，年齡17～61歲，中位年齡31.8歲。

1.3 分組凍存及復(fù)溫

采用終濃度為10%DMSO、≥5%人血白蛋白作為細(xì)胞冷凍保存液，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋調(diào)整至每份干細(xì)胞終濃度在(1～3)×106/ml至(1～3)×108/ml范圍［1］。按上述比例配置混勻后置4℃冰箱備用。在超凈臺(tái)中將冷凍保存液緩慢注入外周血干細(xì)胞采集袋中，同時(shí)輕輕晃動(dòng)采集袋使冷凍保存液與干細(xì)胞充分混合。再將混合后采集袋的干細(xì)胞分裝到200 ml低溫保存血袋中，每袋裝入量不超過(guò)70 ml，4℃冰箱置平衡2 h后立即置于－80℃低溫冰箱。同時(shí)取1混合液于滅菌的低溫保護(hù)管中，每袋留取7管其中6管入－80℃低溫冰箱中保存(簡(jiǎn)稱冰箱組);不采用程控降溫儀，24 h后再取其中3管移到－196℃液氮罐中保存(簡(jiǎn)稱液氮組)［2］，1管做凍存前相關(guān)檢測(cè)。由專人負(fù)責(zé)定期補(bǔ)充液氮。凍存標(biāo)本自冰箱或液氮中取出后，直接投入40℃水浴箱中快速?gòu)?fù)溫，待溶化后立即取出使用。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)

在凍存前、解凍后應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)計(jì)數(shù)，計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞回收率=解凍后MNC/凍存前MNC×100%。臺(tái)盼藍(lán)拒染(typeran blue resistance，TBR)法顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞存活，細(xì)胞存活率=解凍后活細(xì)胞數(shù)/凍存前活細(xì)胞數(shù)×100%。在凍存前、解凍后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算CD34+細(xì)胞回收率=解凍后CD34+細(xì)胞數(shù)/凍存前CD34+細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 外周血干細(xì)胞不同凍存方法的效果比較

液氮組凍存干細(xì)胞1、2、3年后的MNC、CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)拒染率(細(xì)胞活性)與凍存前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，冰箱組凍存干細(xì)胞1、2、3年后的MNC、CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)與液氮組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 外周血干細(xì)胞不同凍存方法的效果比較Tab.1 Comparison of different cryopreservation methods For peripheral blood stem cells ±s)

表1 外周血干細(xì)胞不同凍存方法的效果比較Tab.1 Comparison of different cryopreservation methods For peripheral blood stem cells ±s)

項(xiàng)目 凍存前(n=45)液氮組1年(n=37)冰箱組2年(n=30)3年1年2年3年(n=24)(n=37)(n=30)(n=24)MNC(×108) 4.73 ±1.59 4.05 ±1.61 3.91 ±1.86 3.82 ±1.69 4.01 ±1.87 3.89 ±1.78 3.85 ±1.62 CD34+細(xì)胞(×106) 9.11 ±3.64 8.42 ±3.65 8.52 ±2.10 8.66 ±4.12 8.65 ±2.49 8.72 ±3.15 8.78 ±3.58 TBR/% 98.27 ±1.48 97.22 ±3.11 96.81 ±3.61 95.71 ±4.70 98.12 ±2.39 97.25 ±5.24 96.12 ±4.69

2.2 冰箱組和液氮組不同時(shí)間凍存后細(xì)胞回收率比較

冰箱組凍存干細(xì)胞2、3年后單個(gè)核細(xì)胞回收率與凍存1年后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)，冰箱組凍存1、2、3年后單個(gè)核細(xì)胞回收率與液氮組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)，與凍存1年后比較，2組凍存干細(xì)胞3年后的CD34+細(xì)胞回收率增高差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 冰箱組和液氮組不同時(shí)間凍存后細(xì)胞回收率比較Tab.2 Comparison of cell recovery rate after cryopreservation between two groups at different time points(±s)

表2 冰箱組和液氮組不同時(shí)間凍存后細(xì)胞回收率比較Tab.2 Comparison of cell recovery rate after cryopreservation between two groups at different time points(±s)

與凍存1年比較，(1)P＜0.01

保存時(shí)間 n 冰箱組回收率 液氮組回收率/%MNC CD34+細(xì)胞凍存1 年 37 85.62 ±7.27 92.42 ±1.19 84.77 ±5.02 94.95 ±1.79凍存2 年 30 82.66 ±6.01 93.54 ±3.07 82.24 ±5.13 95.72 ±2.13凍存 3 年 24 80.76 ±8.51 95.02 ±3.13(1)81.39.±5.92 96.39 ±2.41(1)細(xì)胞/%MNC CD34+

3 討 論

隨著造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)移植技術(shù)臨床廣泛的應(yīng)用，最初的骨髓干細(xì)胞移植發(fā)展為外周血造血干細(xì)胞移植。在移植過(guò)程中如何經(jīng)濟(jì)、高效地體外保存外周血造血干細(xì)胞活力，直接關(guān)系到移植成?。?-4］，一直是臨床醫(yī)師需要解決的問(wèn)題。目前HSC的體外保存方法有3種，即4℃非冷凍保存、－196℃液氮和－80℃冰箱冷凍保存。4℃非冷凍保存簡(jiǎn)便易行，但保存時(shí)間僅為3～5 d。－196℃液氮和－80℃冰箱均為冷凍保存，前者能夠長(zhǎng)期有效地凍存干細(xì)胞已是國(guó)內(nèi)外學(xué)者達(dá)成共識(shí)，但由于－196℃的液氮保存法設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、并需專人負(fù)責(zé)定期補(bǔ)充液氮，費(fèi)用昂貴，使得臨床常規(guī)開(kāi)展受限。后者凍存HSC在臨床上已逐步得到應(yīng)用［5］，而關(guān)于 －80℃長(zhǎng)期有效凍存 HSC的報(bào)道甚少。本研究對(duì)45份采集凍存的外周血造血干細(xì)胞分別進(jìn)行－196℃的液氮和－80℃低溫冰箱的3年凍存，兩組所采用的每份凍存液是一致的，均以終濃度為10%二甲亞砜(DMSO)、≥5%人血白蛋白作為細(xì)胞冷凍保存液，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋調(diào)整至每份干細(xì)胞濃度在(1～3)×106/ml至(1～3)×108/ml范圍。研究結(jié)果顯示:冰箱組干細(xì)胞凍存3年后MNC和CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)拒染率與凍存前比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，冰箱組干細(xì)胞凍存3年后單個(gè)核細(xì)胞回收率與凍存1年后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)。這說(shuō)明采用－80℃作為貯存溫度是具有較高的干細(xì)胞回收率及存活率，并且也顯示了－80℃低溫冰箱保存法能夠較長(zhǎng)時(shí)間保存干細(xì)胞的活性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)冰箱組干細(xì)胞凍存1、2、3年后的MNC、CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)與液氮組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，冰箱組1年、2年、3年細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)拒染率分別為97.22%、96.81%、95.71%，與液氮組比較差異無(wú)顯著意義。這表明在3年內(nèi)，采用－80℃低溫冰箱保存法和采用－196℃的液氮保存法對(duì)造血干細(xì)胞的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其凍存效果基本一致，也體現(xiàn)了這2組細(xì)胞生物代謝在低溫中近乎完全停止的特點(diǎn)是基本一致的;同時(shí)表明了本研究所采用的細(xì)胞冷凍保存液方案無(wú)論是在冰箱組還是在液氮組均可有效應(yīng)用于PBSC的保存。－80℃低溫保存法以操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、安全有效、冷凍費(fèi)用低廉為特點(diǎn)優(yōu)于－196℃液氮保存法，其3年凍存時(shí)間又能保持高效的干細(xì)胞活性，值得臨床推廣使用。

臨床上評(píng)價(jià)HSC保存效果主要是用體外方法檢測(cè)干細(xì)胞樣本的MNC、CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)拒染率(細(xì)胞活性)。許多研究發(fā)現(xiàn)MNC計(jì)數(shù)、臺(tái)盼藍(lán)拒染率及CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)是臨床上常用的預(yù)測(cè)重建造血的重要指標(biāo)［6］，尤其是外周血CD34+細(xì)胞可以對(duì)造血/祖細(xì)胞采集量有很好的預(yù)測(cè)［7］。在本研究中，冰箱組和液氮組的HSC隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，CD34+細(xì)胞檢測(cè)的相對(duì)數(shù)逐漸增高，2組凍存的HSC3年后CD34+細(xì)胞回收率增高與凍存1年后CD34+細(xì)胞回收率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，這可能與本研究加入人血白蛋白及采用干細(xì)胞凍存終濃度有關(guān)，人血白蛋白能使細(xì)胞脫水，減少冷凍過(guò)程中胞內(nèi)冰晶形成，阻止復(fù)溫時(shí)細(xì)胞凝集，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提示本研究所采用的細(xì)胞冷凍保存液方案具有理想效果。但這結(jié)論與Xu等［6］的報(bào)道有些不同，需要進(jìn)一步研究探討其中原因，這也反映了CD34+表達(dá)作為預(yù)測(cè)造血干細(xì)胞活性標(biāo)記的復(fù)雜性，CD34+表達(dá)是否能完全代表造血干細(xì)胞活力還有待進(jìn)一步大樣本研究。

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