HPLC法測(cè)定頭孢呋辛酯片的含量

頭孢呋辛酯又名頭孢羥芐四唑甲酸酯、頭孢呋辛乙酰氧乙酯。是半合成第二代頭孢菌素類藥物，具有廣譜、殺菌力強(qiáng)、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶有內(nèi)在穩(wěn)定性，并有良好的人體藥代動(dòng)力學(xué)等特點(diǎn)[1-2]。頭孢呋辛酯的體外滅菌活性與它同若干關(guān)鍵靶向蛋白的結(jié)合抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。頭孢呋辛酯對(duì)多種常見(jiàn)病菌有滅菌活性，對(duì)多種細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，尤其對(duì)多種在腸桿菌中習(xí)見(jiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的酶穩(wěn)定。本文在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[3-6]，建立了頭孢呋辛酯片含量測(cè)定的高效液相色譜法，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 賽默飛世爾U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；AB135-S電子天平（十萬(wàn)分之一）（梅特勒托利多）。

1.2 試劑及試藥 頭孢呋辛酯片（國(guó)藥集團(tuán)致君（深圳）制藥有限公司）：批號(hào)：A211206、A211208、A211210；頭孢呋辛酯片（對(duì)照藥品）：批號(hào)：0407016（葛蘭素史克集團(tuán)公司）；頭孢呋辛酯對(duì)照品：批號(hào)：130492-202104（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純），磷酸二氫銨（分析純）。

2 含量測(cè)定

2.1 含量測(cè)定方法 按照高相色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版二部通則0512）測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.2mol/L磷酸二氫銨溶液-甲醇（62∶38）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm。取頭孢呋辛酯對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1ml中約含0.2mg的溶液，在60℃水浴中加熱至少1小時(shí)，冷卻，得含頭孢呋辛酯Δ3-異構(gòu)體的溶液；另取本品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1ml中約含0.2mg的溶液，經(jīng)紫外光照射24小時(shí)，得含頭孢呋辛酯兩個(gè)E異構(gòu)體的溶液。取上述兩種溶液各10 l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。頭孢呋辛酯A、B異構(gòu)體、Δ3-異構(gòu)體與兩個(gè)E異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間分別約為1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。頭孢呋辛酯A、B異構(gòu)體之間，頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與Δ3-異構(gòu)體之間的分離度均應(yīng)符合要求。

測(cè)定法：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于頭孢呋辛0.125g），置100ml量瓶中，加甲醇25ml，強(qiáng)力振搖使溶解，再用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取10 l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取頭孢呋辛酯對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以頭孢呋辛酯兩主峰面積計(jì)算供試品中C16H16N4O8S的含量。

2.2 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論板數(shù)（n）：按照高效液相色譜法（《中國(guó)藥典》2020年版二部通則0512）系統(tǒng)適用性方法下操作，量取頭孢呋辛酯對(duì)照品溶液10 l，注入色譜儀，記錄色譜圖，量取保留時(shí)間tR和Wh/2，計(jì)算頭孢呋辛酯A異構(gòu)體：n=5.54×（tR/Wh/2）2=5.54×（10.399/0.226）2=1.173×104；頭孢呋辛酯B異構(gòu)體：n=5.54×（tR/Wh/2）2=5.54×（11.608/0.290）2=8.876×103。

2.2.2 線性范圍考察與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取頭孢呋辛酯對(duì)照品150mg，置50ml容量瓶中，用少量甲醇溶解，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密量取1、2、4、5、7.5、10ml分別置50ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取溶液10 l注入色譜儀，記錄色譜圖，量取兩個(gè)主峰面積，由主峰峰面積之和（A）對(duì)溶液濃度（C）線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明：在49.51-495.08 g/ml濃度間，本法線性良好。具體結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

圖1 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于日內(nèi)（0、2、4、6、8h）測(cè)定，計(jì)算主峰峰面積之和日內(nèi)差。結(jié)果表明：本方法的穩(wěn)定性良好。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 進(jìn)樣精密度 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算六次主峰峰面積之和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察進(jìn)樣精密度。結(jié)果表明：本方法進(jìn)樣精密度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批頭孢呋辛酯片，按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，制備6份供試品溶液，依次注入液相色譜儀，計(jì)算各次的主峰峰面積之和與稱樣量之比，計(jì)算6次比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察本方法的重現(xiàn)性，由表中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，本方法重現(xiàn)性良好。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 耐用性試驗(yàn) 取頭孢呋辛酯同批樣品，按照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法改變流速及溫度，考察耐用性。由結(jié)果可見(jiàn)，本方法對(duì)柱溫及流動(dòng)相流速的耐用性良好。具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 含量測(cè)定耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 中間精密度試驗(yàn) 取本品一批，分別由三位試驗(yàn)者在不同時(shí)間測(cè)試含量。由結(jié)果可見(jiàn)，本方法中間精密度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 含量測(cè)定中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取頭孢呋辛酯原料約120mg、150mg和180mg各三份，精密稱定，分別加入100ml量瓶中，再精密稱取處方量輔料（相當(dāng)于頭孢呋辛酯150mg）置量瓶中，用少量甲醇溶解，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，按“含量測(cè)定”項(xiàng)下試驗(yàn)，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，本方法準(zhǔn)確度良好。具體結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 定量限 取空白基線一段，測(cè)量其噪音峰高，將樣品溶液用流動(dòng)相稀釋至適當(dāng)濃度，精密量取10 l注入液相色譜儀，使2個(gè)主峰峰高均約為噪音峰高的10倍，此時(shí)的進(jìn)樣濃度為0.025 g/ml，故定量限為0.25ng，具體見(jiàn)圖2。

圖2 頭孢呋辛酯定量限HPLC圖

2.2.10 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)對(duì)含量方法學(xué)驗(yàn)證后，對(duì)市售品及自對(duì)照藥品進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3 含量測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表9）

表9 含量測(cè)定結(jié)果

4 討論和結(jié)論

高效液相色譜法測(cè)定頭孢呋辛酯含量的液相條件下，頭孢呋辛酯A異構(gòu)體、B異構(gòu)體、Δ3異構(gòu)體、E異構(gòu)體1、E異構(gòu)體2分離度良好，頭孢呋辛酯A異構(gòu)體、B異構(gòu)體理論塔板數(shù)符合要求，穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、耐用性、中間精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果也符合要求，表明方法可行，可用于該制劑的含量測(cè)定和穩(wěn)定性分析，并為質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。