多級冷凝耦合GC-MS分析金銀花中揮發(fā)性物質*

馬 飛，賴玥華，黃 頌，劉旎璇，段春娜

(贛南師范大學 地理與環(huán)境工程學院，江西省城市固廢低碳循環(huán)技術重點實驗室，江西 贛州 341000)

在中國的傳統(tǒng)醫(yī)學中，金銀花(Lonicera japonica)作為治療普通感冒和發(fā)燒使用已有數(shù)千年的歷史[1].同時，因其獨特的藥用功效和芳香氣味，而被廣泛的應用作為茶飲料的原料[2].化學成分研究表明，金銀花富含有機酸、黃酮類化合物、皂苷、揮發(fā)油和芳香性物質[3-6].特別是，揮發(fā)油(揮發(fā)性組分)作為金銀花氣味和發(fā)揮藥理作用的主要組成部分，將其應用于茶，食品和香煙等制品，有助于提升香味和口感[7].因此，從金銀花中提取揮發(fā)性成分，并揭示揮發(fā)性成分與氣味之間的關系具有重要的意義和價值.

從植株中提取揮發(fā)性成分的傳統(tǒng)方法包括，加速溶劑萃取(ASE)、蒸餾提取(SD)和同時蒸餾提取(SDE)[8-11].然而，這些方法在使用時均存在一定的局限性，如過程耗時，操作繁瑣，需使用大量的溶劑等[12].因此，更多先進的萃取技術被開發(fā)，以達到小溶劑提取，高產(chǎn)量回收的目的[13].例如，超臨界流體萃取(SFE)、加壓液體萃取(PLE)、超聲波輔助萃取(UAE)等[14-18].但是，由于以上設備投資成本高、技術操作專業(yè)性強，因此在大范圍推廣應用方面受到一定的局限.多級冷凝作為一種操作簡單，成本相對較低的粗分離技術，應用得當可有效降低后續(xù)分離和純化的技術成本[19].在多級冷凝過程中，依據(jù)樣品蒸氣中各組分不同的物理和化學特性，熱解的樣品蒸氣將通過系列溫度點的冷凝器被逐級冷凝，達到樣品分離的目的[20].目前，多級冷凝技術已被廣泛應用于生物質資源富集[21-23].同時，有研究人員發(fā)現(xiàn)利用多級冷凝可以更有效地將生物油中的某些成分分離出來，并提高生物油的品質[24-27].多級冷凝技術因具有溶劑消耗少，操作簡單和回收方便等優(yōu)點，近年來被改進用于分析煙草中的復雜揮發(fā)性成分，并從中成功的收集到30種重要的與煙草氣味和口感相關的揮發(fā)性成分[28].

基于以上，本文通過構建多級冷凝裝置，優(yōu)化蒸發(fā)溫度、載氣流量和冷凝區(qū)間等參數(shù)，收集到一系列金銀花揮發(fā)性組分，進一步結合GC-MS分析各組分在多級冷凝裝置中的分布特點并描述其氣味特征.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QP2010Plus GC-MS(含自動采樣機型號AOC-20I，日本島津公司)；XL-45自增壓液氮罐(泰來華頓，美國)；GBRT-高溫套式恒溫器(上海學森儀器有限公司)；

金銀花(廣州同仁堂藥房)；500 mL乙醇(分析純)；500 mg乙酸苯乙酯(標準品，百靈威科技有限公司)；1 mg/mL C4-C30烷烴混標(百靈威科技有限公司)；1 000 mL叔丁基甲基醚(99%純度，百靈威科技有限公司).

1.2 實驗裝置

構建的多級冷凝裝置同文獻[28]，詳見圖1.該裝置由5個部分組成：冷源、蒸發(fā)器、冷源傳輸線、冷凝器和采樣管.采樣管采用玻璃材質(L型設計結構，長度20 cm)，冷凝器由兩對傳輸板組成(單板尺寸，長×寬×高：1 m×20 cm×1 cm).冷源傳輸線(S形彎曲銅管：內徑5.0 mm，長度5.0 m)，位于傳輸板底部，作為冷源傳輸通道.通過改變冷源傳輸線的排列間距，設計3種不同模型，作為后續(xù)溫度范圍優(yōu)化.(型號1：18.0 cm,16.0 cm,13.0 cm,12.0 cm,9.5 cm,11.0 cm,11.5 cm,10.0 cm,11.0 cm,10.0 cm,10.0 cm,9.5 cm,8.5 cm,8.0 cm,7.0 cm;型號2:18.0 cm,16.0 cm,12.0 cm,12.0 cm,8.0 cm,10.5 cm,12.5 cm,10.5 cm,12.5 cm,8.5 cm,10.0 cm,9.5 cm,11.5 cm,7.5 cm,7.0 cm;型號3:23.5 cm,16.0 cm,15.0 cm,11.5 cm,11.5 cm,9.5 cm,12.0 cm,11.5 cm,14.0 cm,12.5 cm,12.0 cm,10.5 cm,10.0 cm,8.5 cm,7.0 cm,7.0 cm.)

圖1 金銀花揮發(fā)油多級冷凝示意圖

1.3 標準溶液配制

準確稱量0.135 g苯乙酸乙酯于100 mL容量瓶中，并用叔丁基甲基醚(TBME)稀釋至刻度線，配制成濃度為1.35 mg/mL的內標溶液.

1.4 樣品捕集流程

取30.0 g金銀花放入蒸發(fā)器，恒溫(150 ℃)加熱蒸發(fā)樣品.采用液氮為冷源，使用自增壓裝置調整冷凝溫度區(qū)間并保持相對穩(wěn)定.以N2為載氣，以恒定流量1 000 mL/min將蒸發(fā)的金銀花揮發(fā)組分送入多級冷凝器并持續(xù)冷凝30 min，向每根捕集管中加入2.0 mL的乙醇，搖動并充分的溶解后轉移1.0 mL至事先準備好的色譜瓶，以備GC-MS分析.

1.5 氣質條件

通過氣相色譜-質譜儀(GC-MS)對揮發(fā)性組件進行定性分析，RTX-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm；薄膜厚度0.25 μm).程序升溫條件：以2 ℃/min從60 ℃增加到180 ℃，并以5 ℃/min進一步提高到230 ℃(保持15 min).其他設置條件如下：進樣口溫度為260 ℃，載氣(He)恒定流量為2.0 mL/min，接口溫度為240 ℃；電離：EI70 eV，分流比1∶10，溶劑延遲時間為2.5 min.

2 結果和討論

2.1 多級冷凝溫度優(yōu)化

為便于考察冷凝溫度對樣品組分多級冷凝影響，穩(wěn)定而寬泛的溫度梯度是前提條件.在冷凝器固定的情況下，冷源的初始溫度和冷源傳輸間隔對冷凝器整體溫度影響較大.以液氮(-196 ℃)為冷源，通過自增壓控制冷源傳輸量維持溫度穩(wěn)定性，研究不同冷源轉移間距對溫度梯度的影響，如表1所示.利用溫度傳感器分別測量模式1、模式2和模式3條件下，形成的溫差區(qū)間為：57 ℃、67 ℃和65 ℃.顯然，模式2條件下，形成的溫差區(qū)間更加寬泛.

表1 冷源轉移間距對溫度的影響

在以上模式2的條件下，保持冷源傳輸量和冷源傳輸間距不變，平行3次實驗，考察冷凝器溫度區(qū)間的穩(wěn)定性，如表2所示.通過3次平行實驗，冷凝溫度平均偏差為0.43，相對標準偏差為0.85%，說明構建的冷凝器溫度區(qū)間相對穩(wěn)定，具有較好的重復性.

表2 冷凝溫度區(qū)間穩(wěn)定性

2.2 樣品捕集過程

根據(jù)相同溫度下，沸點和飽和蒸汽壓之間的差異，當揮發(fā)性物質被引入冷凝器時，各組分在不同溫度點的捕獲管中被逐級凝結，以達到分離的目的.

2.2.1 樣品蒸發(fā)溫度的影響

樣品揮發(fā)速率和揮發(fā)組分受樣品蒸發(fā)溫度的影響，溫度越高，樣品蒸發(fā)越快，單位時間內揮發(fā)性組分越多.但隨著蒸發(fā)溫度增加，部分揮發(fā)性物質易發(fā)生熱解，同時維持冷凝所需的冷量消耗也增加.在相同的載氣流量(1 000 mL/min)、相對穩(wěn)定的冷凝溫度區(qū)間(-61 ℃～6 ℃)條件下，分別考察蒸發(fā)溫度為100 ℃、150 ℃和200 ℃時冷凝多級捕集效果.結果表明，在蒸發(fā)溫度從100 ℃增加至150 ℃時，被冷凝器捕集的揮發(fā)性組分數(shù)量明顯增加，150 ℃時共收集到66種揮發(fā)性組分.但繼續(xù)增加溫度至200 ℃時，揮發(fā)性組分僅增加5種，且代表金銀花的風味和香氣成分的含量并未增加.說明采用150 ℃作為蒸發(fā)溫度，不僅能夠獲得金銀花特征揮發(fā)性組分，而且所需的能耗更低，可作為最佳條件使用.

圖2 不同蒸發(fā)溫度下金銀花樣品總離子流圖

2.2.2 載波氣體流量的影響

為探索載氣流量對樣品揮發(fā)性組分多級冷凝的影響，在相同實驗條件下，分別考察600 mL/min和1 000 mL/min的載氣流量下，揮發(fā)性組分在冷凝捕集1#、5#、10#和15#管中被冷凝情況，如圖3所示.當載氣流量較小時(600 mL/min)，揮發(fā)性組分主要集中在前5根冷凝捕集管中，冷凝組分相對集中，多級效果不明顯；載氣流量較大時(1 000 mL/min)，揮發(fā)性組分被多級冷凝到15根冷凝捕集管中，冷凝組分相對分散，更有利于后續(xù)各組分的分離和純化.以上結果表明，在冷凝溫度一定的情況下，較快的載氣流速更有利于揮發(fā)性組分的傳輸和擴散，有助于各組分在多級冷凝器的多級分離.

圖3 在600 mL/min和1 000 mL/min的載氣流量下，捕集管中樣品組分的總離子色譜

2.3 揮發(fā)性組分物性及分布特征

選擇在蒸發(fā)溫度150 ℃，載氣流量1 000 mL/min，冷凝溫度區(qū)間6 ℃～ -61 ℃條件下，收集各捕集管中揮發(fā)性組分，將收集的樣品取1 μL進GC-MS分析，結果共分析出66種化合物，主要成分32種，包括：4種有機酸、7種酚類、8種酮類、3種醇類、2種醛類、2種酯類和6種雜環(huán)類化合物.

揮發(fā)性物質的分布特征與沸點和飽和壓力有很大關系，沸點較高的揮發(fā)性物質將首先被凝結.丙酸(沸點：414.25 K，飽和壓力：1.33 kPa(39.7 ℃)，相對百分比含量：3.55%)主要被集中冷凝在1#～4#捕獲管.丁酸(沸點：436.65 K，飽和壓力：0.10 kPa(25 ℃)，相對百分比含量：0.75%)主要被冷凝在1#～2#捕獲管.僅在1#捕獲管中檢測到戊酸(沸點：459.65 K，相對百分比含量：1.10%).結果表明，沸點較高的揮發(fā)性成分在捕獲管中的分布較窄，同時7種酚類酸性有機物，主要分布在1-8#捕集管.例如：丁香酚具有丁香味、鄰苯二酚具有辛辣氣味，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域.此外，酮類和醛類化合物作為重要的揮發(fā)性物質也被多級冷凝在不同捕集管.

表3 揮發(fā)性組分的氣味和分布特征

2.4 揮發(fā)性成分粗回收

相較于單級冷阱或二級/三級串聯(lián)冷阱，本文構建的多級冷凝裝置可提供更加多樣的溫度點和更廣泛的冷凝區(qū)間.苯甲醛和環(huán)己酮作為金銀花揮發(fā)油中的代表性物質，其在香料、有機合成、食品和制藥等領域具有較好的應用價值.

如表4和表5所示，苯甲醛和環(huán)己酮分別被該裝置冷凝在1#～12#和1#～8#捕集管.將冷凝捕集管1#、7#、8#和10#內組分進行回收，獲得的苯甲醛占總回收組分的57.14%；同理，將冷凝捕集管2#、5#和6#內組分進行回收，獲得的環(huán)己酮占回收組分的68.14%.因此，通過以上實驗表明：基于多級冷凝分離，選擇不同捕集管可實現(xiàn)苯甲醛和環(huán)己酮與其他化合物的粗分離和粗回收.

表4 苯甲醛的粗分離

表5 環(huán)已酮的粗分離

3 結論

通過構建一套多級冷凝裝置，獲得穩(wěn)定而寬泛的溫度區(qū)間.在最佳條件下：冷凝溫度范圍在6 ℃～-61 ℃，樣品烘烤溫度150 ℃，載氣流量1 000 mL/min.利用GC-MS從金銀花揮發(fā)油中分析出32種主要組分，其中42.42%物質對金銀花香味具有貢獻.同時，采用多級冷凝技術實現(xiàn)57.14%的苯甲醛和68.14%的環(huán)己酮粗分與回收.該技術對溫度較敏感的天然產(chǎn)物中揮發(fā)性與半揮發(fā)性物質的分離與回收具有潛在的應用價值，后續(xù)有望通過工藝和能耗優(yōu)化，發(fā)展成為一種新型的分離回收技術.