微絲解聚因子（cofilin）對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和浸潤(rùn)的影響

呂士紅 王長(zhǎng)杰 朱洪春 楊白婧

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江牡丹江 157000

膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、無(wú)突膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元有支持和引導(dǎo)遷移的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，參與髓鞘的形成，參與血腦屏障。發(fā)生在神經(jīng)外胚層的膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤，起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，惡性膠質(zhì)瘤的五年生存率低，平均生存期短[1]。延長(zhǎng)患者的生存期，提高患者生活質(zhì)量是科研和醫(yī)療工作者的急迫任務(wù)。細(xì)胞骨架的功能包括維持細(xì)胞形態(tài)、保持內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)有序性、基因表達(dá)、細(xì)胞分化，微絲是細(xì)胞骨架的主要成分之一[2]。微絲解聚因子（cofilin）是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)微絲骨架重建，影響其細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等功能[3-4]。本研究分析cofilin 對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和浸潤(rùn)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）株來(lái)自牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，包括基因沉默GSC 細(xì)胞（對(duì)照組）與過(guò)表達(dá)cofilin 的GSC 細(xì)胞（觀察組）。細(xì)胞培養(yǎng)液（賽默飛），10%胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)箱（博科集團(tuán)），熒光顯微鏡（奧林巴斯）。Tracking Tool PRO v2.1 軟件，Transwell 實(shí)驗(yàn)板。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 10% 胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，37℃，5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d 細(xì)胞傳代一次。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)[5]將所用的器械消毒滅菌。在6 孔板上使用記號(hào)筆過(guò)孔均勻劃線，間隔1 cm。在6 孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞完全生長(zhǎng)融合，再進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用移液器洗頭垂直劃線用力均勻勻速劃痕，用PBS 液洗滌。將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，分別于0、12 以及48 h，用顯微鏡拍攝細(xì)胞圖片。用Image J 軟件測(cè)量細(xì)胞的測(cè)量距離。遷移速率=（0 時(shí)的傷口寬度-觀察時(shí)點(diǎn)的傷口寬度）/0 h 時(shí)傷口寬度×100%，評(píng)價(jià)cofilin 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響。

1.2.3 浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)[5]制備Transwell 小室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600 μl。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞0.25%的胰蛋白酶消化，PBS 清洗3 次，用細(xì)胞培養(yǎng)液（無(wú)血清）制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/ml。Transwell 板做好標(biāo)記，取300 μl 細(xì)胞懸液加入Transwell 板的上室，移入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，刮出未浸潤(rùn)細(xì)胞，甲醛固定，晾干，吉姆薩液避光染色，PBS 液洗滌3 次。晾干，顯微鏡下隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿越小室膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)cofilin 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移速率比較

24、48 h 觀察組膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移速率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移速率比較（%，±s）

組別n24 h48 ht 值P 值觀察組 633.32±5.6168.95±4.3312.3150.000對(duì)照組 613.18±2.1625.22±3.477.2150.000 t 值8.20619.304 P 值0.0000.000

2.2 兩組膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)個(gè)數(shù)比較

觀察組觀察到的膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)個(gè)數(shù)[（196.33±38.43）個(gè)]顯著高于對(duì)照組[（83.26±25.52）個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.481，P=0.001）。見(jiàn)圖1。

3 討論

膠質(zhì)瘤占腦腫瘤的40%～50%，臨床常見(jiàn)。膠質(zhì)瘤很難根治，術(shù)后往往容易復(fù)發(fā)，不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤預(yù)后各不相同，高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者病情進(jìn)展較快，術(shù)后短時(shí)間內(nèi)就可復(fù)發(fā)，生存時(shí)間也往往相對(duì)較短。對(duì)膠質(zhì)瘤的治療主要是早發(fā)現(xiàn)、早治療，以改善預(yù)后。微絲與微管、中等纖維共同組成細(xì)胞質(zhì)骨架。細(xì)胞質(zhì)骨架具有彌散性、整體性、變動(dòng)性，維持細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、信息傳遞、基因表達(dá)、細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。真核細(xì)胞中的微絲由肌動(dòng)蛋白組成，直徑7 nm，程度不一，實(shí)心細(xì)絲狀骨架纖維。微絲具有支架功能，肌肉收縮功能，細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)、保質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞內(nèi)吞、外涂，細(xì)胞分裂，細(xì)胞分化，微絨毛收縮，信息傳遞等作用[6-8]。cofilin 蛋白通過(guò)磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH 改變等進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和解聚F 肌動(dòng)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑，從而調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的重組[9-11]。在神經(jīng)細(xì)胞中，細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白在多種重要的生理活動(dòng)中發(fā)揮作用，包括肌肉收縮，胞質(zhì)，神經(jīng)纖維再生，神經(jīng)纖維退行性改變等。在這個(gè)過(guò)程中還需要一些調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合和解聚的蛋白參與。在一定條件下，cofilin 蛋白可使肌動(dòng)蛋白微絲解聚，從而影響細(xì)胞骨架蛋白動(dòng)力學(xué)。從基因上，cofilin 基因主要有cofilin-1 和cofilin-2，表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。cofilin-1 主要表達(dá)在非肌肉組織，尤其以腦組織為主。而cofilin-2 主要表達(dá)在肌肉組織中，例如骨骼肌、心肌等。cofilin-1 參與神經(jīng)元的分化。在神經(jīng)細(xì)胞中，微絲的解聚與重塑影響神經(jīng)元的極化以及樹(shù)突和軸突的形成，cofilin-1 通過(guò)解聚微絲參與神經(jīng)元的分化過(guò)程。cofilin-1 調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的變化，影響神經(jīng)元的定向運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育以及損傷后的修復(fù)過(guò)程。cofilin 蛋白還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的可塑性[12]。

研究顯示，食管癌組織cofilin-1 陽(yáng)性高表達(dá)與臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差有關(guān)[13]。王靜等[14]的研究結(jié)果也顯示，cofilin-1 的表達(dá)水平與慢性粒細(xì)胞白血病患者的不良生存預(yù)后有關(guān)。cofilin-1 與胃腸道間質(zhì)瘤浸潤(rùn)的深度、腫瘤的直徑、病理性核分裂象正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相似，過(guò)表達(dá)cofilin 的GSC 單核細(xì)胞遷移速率要顯著高于基因沉默的細(xì)胞，發(fā)生浸潤(rùn)的細(xì)胞個(gè)數(shù)也顯著多于基因沉默的細(xì)胞（P< 0.05）。cofilin 通過(guò)誘導(dǎo)片狀偽足的形成，進(jìn)而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向。cofilin參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及形態(tài)的改變，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[16-17]。本研究未對(duì)cofilin 影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)的具體機(jī)制進(jìn)行研究，期待在今后的研究中進(jìn)一步分析。

綜上所述，cofilin 可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)，可能與cofilin 參與膠紙瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、信息傳遞、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)等有關(guān)，期待在今后的研究中能夠?qū)唧w機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析。