循環(huán)腫瘤DNA在卵巢癌診斷和治療中的應(yīng)用

孫玉瑩，段 微

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科腫瘤，北京 100010)

1 卵巢癌的診治現(xiàn)狀

婦科惡性腫瘤中卵巢癌的死亡率最高。由于缺乏有效的篩查和檢測工具，加之早期缺乏臨床癥狀，70%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，且70%的晚期上皮性卵巢癌患者會在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。卵巢癌早期診斷治療更有效，預(yù)后也更好，I期卵巢癌5年生存率可達90%，Ⅱ期卵巢癌5年生存率為70%。但是，大多數(shù)病例直到癌癥擴散后才被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致5年生存率不到30%[1]。在卵巢癌不同階段，治療方法主要有卵巢癌減滅手術(shù)、化療、激素或靶向治療，但相當一部分卵巢癌手術(shù)看似達到無腫瘤細胞殘存狀態(tài)(R0)，并化療至完全緩解(CR)，實際上仍存在微小殘留病灶或已出現(xiàn)隱匿性微小轉(zhuǎn)移。如果在卵巢癌早期作出診斷、治療早期預(yù)測治療療效以及疾病復(fù)發(fā)早期發(fā)現(xiàn)，將大大提高患者生存率，或個性化制定治療方案。

傳統(tǒng)卵巢癌的診斷篩查方法包括常規(guī)組織活檢、經(jīng)陰道超聲(TVUS)、計算機斷層掃描(CT)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)以及腫瘤抗原CA125檢測。影像學(xué)手段能幫助識別卵巢及其他部位的腫瘤組織，但無法提供明確的診斷，不能準確進行良、惡性腫瘤的鑒別診斷，且對于病灶較小的腫瘤組織無法精準的檢測。組織活檢的有創(chuàng)性以及腫瘤組織的異質(zhì)性也阻礙了組織活檢的發(fā)展[2]。目前CA125是卵巢癌的特異性生物標記物，也是臨床監(jiān)測的重要參考標準。CA125在良性疾病及其他惡性腫瘤中表達升高，因此特異性有限，因此尋找更可靠的卵巢癌篩查和診療標志物尤為迫切。

2 ctDNA的優(yōu)勢

過去幾十年，越來越多的研究表明了液體活檢技術(shù)在腫瘤篩查和診療中的應(yīng)用潛力[3]。癌癥是一種與基因組改變相關(guān)的分子疾病，由于基因突變檢測技術(shù)靈敏度大大提高，血液中循環(huán)的細胞DNA中可識別出癌細胞或癌組織，這就是液體活檢。美國國家癌癥研究所將液體活檢定義為“對血液樣本進行的檢測，以尋找血液中循環(huán)的腫瘤細胞或血液中腫瘤細胞的DNA片段”。腫瘤患者外周血中的循環(huán)游離DNA(circulating-free DNA，cfDNA)來自多種細胞，包括癌細胞，腫瘤微環(huán)境的其他細胞，非腫瘤細胞(如造血干細胞，肌肉細胞、上皮細胞)等[4]。腫瘤細胞來源的DNA片段稱為ctDNA。ctDNA除存在于外周血，也存在于其他體液，如腹水、乳汁、淋巴液、腹膜液、腹腔灌洗液、胃液、腦脊液等樣本中。相比于腫瘤組織活檢檢測，ctDNA作為腫瘤診療的潛在生物標記物有以下優(yōu)勢[1]：(1)微創(chuàng)性。腫瘤組織活檢標本的獲取可能存在巨大手術(shù)風(fēng)險，相比之下，ctDNA檢測創(chuàng)傷較小。研究指出，在胰腺癌(高達75%)、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌、胃食管癌和黑色素瘤以及原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(高達50%)、腎癌、前列腺癌中均檢測到ctDNA[5]。其中，在高級別漿液性卵巢癌中，TP53突變率高達90%，ctDNA檢出率約為75%～100%，具有重要研究價值[6],BRCA1/2檢出率為25%，也有一定意義。(2)實時性。對于部分晚期或復(fù)發(fā)患者，很難取到組織標本進行檢測，而ctDNA檢測可實時反映患者體內(nèi)的腫瘤突變及腫瘤負荷，為患者的個性化診療提供更多機會。研究表明，ctDNA的半衰期約為16min至2h，因此ctDNA有望作為腫瘤實時狀態(tài)的監(jiān)測，如血漿ctDNA可預(yù)測60%的早期直腸癌，且發(fā)現(xiàn)ctDNA數(shù)量與腫瘤體積相關(guān)[1]。(3)無空間異質(zhì)性。腫瘤是一種異質(zhì)性較高的疾病，只通過部分腫瘤組織的檢測可能漏檢重要變異信息。ctDNA檢測能更全面地反映體內(nèi)所有腫瘤病灶(包括原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)的分子異常情況。大量研究顯示，ctDNA用于肺癌的常規(guī)管理，以監(jiān)測克隆進化和識別使用酪氨酸激酶抑制劑耐藥的患者。隨著ctDNA檢測技術(shù)的快速發(fā)展，其在腫瘤的全程診療管理中也發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。

3 ctDNA在卵巢癌診治中的應(yīng)用

3.1 ctDNA在卵巢癌早篩早檢中的應(yīng)用 目前在卵巢癌早期診斷中，臨床最常用的是CA125、經(jīng)陰道超聲及其他輔助檢查的聯(lián)合。卵巢癌早期病灶太小,血液中CA125水平并不升高，約有50%的I期卵巢癌患者CA125處于正常水平。且CA125可在其他良性疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎性疾病中升高。部分卵巢癌起源于輸卵管，但由于輸卵管常顯示不清，CA125聯(lián)合TVUS對早期卵巢癌的檢出率并不高。因此，CA125作為卵巢癌診斷的腫瘤標志物缺乏特異性[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，血漿ctDNA具有作為癌癥微創(chuàng)診斷工具的潛力，特別是針對高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)。TCGA數(shù)據(jù)顯示，約90%的HGSOC患者具有TP53突變。既往研究表明，ctDNA檢測TP53突變具有>75%的靈敏度和>80%的特異性。也有研究基于ctDNA的拷貝數(shù)變異輔助診斷卵巢癌，相比TP53突變，靈敏度略有下降[8]。除外周血ctDNA檢測外，近年也有研究指出，腹水也可進行ctDNA突變檢測。Han等選取了10例EOC患者，9例患者的腫瘤組織和腹水ctDNA中均存在體細胞突變，證實了這種突變的一致性。因此,血漿ctDNA與CA125聯(lián)合檢測可提高卵巢癌早期診斷的敏感性,且腹水ctDNA可能比血漿ctDNA更適用于識別卵巢癌的突變情況并協(xié)助制定治療策略。此外發(fā)現(xiàn)，連續(xù)血漿樣本中提取的ctDNA與EOC進展、復(fù)發(fā)時間相似，比CA125更快[9]。然而，TP53功能性失活突變及拷貝數(shù)變化是多種實體瘤常見的分子異常事件，當TP53突變時，仍需結(jié)合其他臨床癥狀進行卵巢癌的綜合診斷。

近幾年，隨著ctDNA甲基化技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，目前在腫瘤早篩中有較大潛力。2017年Widschwendter等通過對699例腫瘤患者和非腫瘤患者組織的甲基化狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)了3個DNA甲基化標志物用于區(qū)分腫瘤患者和健康/良性腫瘤患者，靈敏度和特異性分別為41.4%和90.7%。通過化療后ctDNA甲基化狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)ctDNA甲基化標志物能正確識別78%的化療響應(yīng)和86%的無響應(yīng)患者，優(yōu)于CA125(35IU/mL)的監(jiān)測能力(20%和75%)[10]。2020年Liu等探索了基于cfDNA甲基化特征預(yù)測多種腫瘤以及進行腫瘤溯源的可行性。研究共納入6689例參與者(包含2482例腫瘤患者以及4207例非腫瘤患者)，結(jié)果顯示，驗證組中cfDNA甲基化在預(yù)測12種腫瘤(包含卵巢癌)中的特異性為99.3%，Ⅰ～Ⅲ期腫瘤的靈敏度為67.3%。通過cfDNA甲基化進行腫瘤發(fā)生部位溯源準確率可達93%，其中進行卵巢癌腫瘤溯源在訓(xùn)練組和驗證組中的準確性分別為96%和100%[11]。通過DNA甲基化進行腫瘤預(yù)測后續(xù)有待前瞻性的驗證結(jié)果。此外，ctDNA檢測還可與多種其他生物標志物聯(lián)合使用，如CA125、表觀遺傳標記物、循環(huán)腫瘤RNA、核小體、外泌體和相關(guān)免疫標記物等，從而成為早期癌癥檢測分析的關(guān)鍵組成部分，而且更適用于目前尚未使用ctDNA篩查的癌癥，如卵巢癌、胰腺癌和胃癌等[6]。綜上，ctDNA是一種可行的卵巢癌診斷性生物標志物。

3.2 ctDNA在患者治療中的應(yīng)用 如果能在卵巢癌治療的早期階段預(yù)測治療療效，患者可選擇更適當?shù)闹委煼桨福貏e是對化療方案的選擇。因此，ctDNA檢測方法可能徹底改變現(xiàn)有的卵巢癌管理方案。

3.2.1 ctDNA檢測指導(dǎo)晚期患者精準治療 Oikkonen等分析12例高級別漿液性卵巢癌患者治療前、治療期間和治療后的78個血漿ctDNA樣本，結(jié)果顯示，ctDNA和腫瘤樣本的突變和拷貝數(shù)改變具有很好的一致性，并在7例患者(58%)中檢測到與臨床可用藥物相關(guān)的改變,證明可使用ctDNA指導(dǎo)臨床治療。此外，該研究結(jié)果還顯示,縱向ctDNA樣本可用于識別第一個化療周期后反應(yīng)較差的患者。因此縱向ctDNA取樣可用于監(jiān)測對一線治療的反應(yīng)，并識別HGSOC中反應(yīng)不良的患者[12]。Noguchi等[13]研究中，檢測了51例不同組織學(xué)類型卵巢癌患者血漿中的ctDNA基因突變譜，發(fā)現(xiàn)94%患者有一個或多個非同義體細胞突變，其中最常見的是高級別漿液性卵巢癌患者中的TP53基因突變。分析ctDNA與臨床病理類型及預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，ctDNA濃度較高時，患者的無進展生存期較差；使用ctDNA可識別個體卵巢癌患者的臨床基因組圖譜，可作為一個有用的預(yù)后指標，因此基于ctDNA的基因圖譜可能有助于制定個性化的治療策略。此外，還有研究[14]收集了44例婦科癌癥患者在手術(shù)期間和整個治療過程中的腫瘤組織和血清樣本(包括22例卵巢癌，17例子宮體癌，1例腹膜癌，3例輸卵管癌，1例同時存在輸卵管癌和子宮癌)，其中93.8%的患者檢測到ctDNA，且ctDNA水平與血清CA125和CT掃描結(jié)果高度相關(guān)。相關(guān)研究[15]選取了105例卵巢、子宮、宮頸、外陰陰道和不明的婦科原發(fā)性腫瘤患者的血漿和組織，通過實驗分析得出結(jié)論，較高的ctDNA最大突變等位基因頻率與總生存率較差相關(guān)，與ctDNA改變相匹配的治療與改善的總生存率獨立相關(guān)。組織和ctDNA基因組結(jié)果有較高的一致性(其中大多數(shù)卵巢癌和子宮癌86%為高級別；34%的卵巢癌有BRCA改變，22%為鉑敏感)。以上研究均顯示了組織和ctDNA基因組結(jié)果有較高的一致性。因此ctDNA檢測可應(yīng)用于婦科癌癥患者的預(yù)后和個體化治療中。此外，研究還表明，在婦科癌癥中應(yīng)用ctDNA相對于目前使用的血清和影像學(xué)檢查，更能動態(tài)地預(yù)測治療反應(yīng)。

3.2.2 ctDNA動態(tài)監(jiān)測提示卵巢癌治療療效和藥物耐藥機制與預(yù)后 目前大部分研究均顯示，體細胞TP53突變是高級別漿液性卵巢癌的一個特征性發(fā)現(xiàn)。Kim等[16]研究中，選取61例HGSOC患者的103例腫瘤組織進行直接測序分析，結(jié)果顯示67.2%的患者有TP53突變。并且所有患者的體細胞突變均發(fā)生在漿細胞游離DNA。對診斷為HGSOC和TP53突變的患者，根據(jù)療程隨訪ctDNA、CA125和CT，ctDNA顯示了作為腫瘤特異性治療反應(yīng)監(jiān)測的生物標志物的潛力。治療后3個月的TP53突變的患者ctDNA水平比CA125具有顯著的預(yù)測效果。此外，PIK3CA和KRAS已被證實是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中最常見的突變基因[17]，它們的突變已被識別出來，可進行高度敏感分析。上述研究篩選了306例患有PIK3CA或KRAS體細胞突變的卵巢癌患者。其中85例EOC患者存在體細胞PIK3CA和(或)KRAS突變，隨后使用血漿中的液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)分析相應(yīng)的突變。ctDNA在EOC患者中的檢出率為27%。其中晚期患者和腹膜細胞學(xué)陽性患者ctDNA檢測頻率較高。因此ctDNA檢測被認為是預(yù)后指標，多因素分析顯示ctDNA也是預(yù)測復(fù)發(fā)的獨立危險因素。研究還評估了17例患者術(shù)前和復(fù)發(fā)時匹配血漿中的突變頻率，發(fā)現(xiàn)6例患者復(fù)發(fā)時的細胞游離DNA突變率高于初級診斷時的突變率。因此ctDNA升高可能是監(jiān)測復(fù)發(fā)的一個指標，這表明即使診斷時腫瘤是局部的，也可能發(fā)生腫瘤擴散[17]。

目前，PARPi用于治療BRCA1/2突變以及HRD的卵巢癌患者已進入卵巢癌臨床標準治療路徑，然而，盡管PARP抑制劑可顯著提高晚期卵巢癌患者的生存期，但是部分患者仍不可避免地進展為耐藥性患者。越來越多的PARP抑制劑的耐藥機制也相繼報道。通過ctDNA的動態(tài)監(jiān)測也可探索卵巢癌PARPi的潛在耐藥機制。2019年ARIEL2隨訪研究中通過ctDNA標準對具有BRCA1/2突變的患者在PARP抑制劑治療前和進展后進行檢測，發(fā)現(xiàn)18%的鉑難治患者和13%的鉑耐藥患者具有BRCA回復(fù)突變，而在鉑敏感的患者中僅有1例。經(jīng)PARP抑制劑治療后，78例疾病進展患者中有8例患者檢出BRCA的回復(fù)突變[18]。通過ctDNA檢測在乳腺癌和卵巢癌鉑類/PARP抑制劑耐藥的患者中檢出BRCA的回復(fù)突變[19]。因此可通過cfDNA測序分析檢測卵巢癌PARP抑制劑或鉑耐藥患者的突變。

3.3 ctDNA在卵巢癌治療反應(yīng)中的預(yù)測作用 在卵巢癌治療前，檢測ctDNA將有助于早期發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)患者的分期做出適當?shù)闹委?。在治療過程中，定期監(jiān)測ctDNA可闡明從基因改變獲得的耐藥性，這是現(xiàn)在常規(guī)方法檢測不到的。此外，ctDNA還可檢測殘留病灶，有助于預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，基于ctDNA的藥物反應(yīng)預(yù)測可打開卵巢癌治療的新視野[20]。研究表明，ctDNA評估可能對預(yù)后和治療都有意義，在婦科癌癥患者中提供個體化的癌癥治療。較高的ctDNA最大突變等位基因頻率與較差的總生存率相關(guān)，與ctDNA基因組改變相匹配的治療和與ctDNA基因組改變不匹配的治療相比發(fā)現(xiàn)，相匹配的治療總生存率更高。組織和ctDNA基因組結(jié)果顯示出較高的一致性，不受時間和空間因素的影響。需更多的研究來更好地定義ctDNA評估在婦科癌癥治療中的作用[15]。對于晚期癌癥患者，液體活檢檢測可用于治療選擇、監(jiān)測治療效果及在耐藥性發(fā)展時確定最合適的后續(xù)治療。

3.4 ctDNA作為MRD(微小殘留病灶)生物標志物的應(yīng)用 原發(fā)腫瘤治療，可通過檢測到的微轉(zhuǎn)移性疾病來提高生存率。相當一部分看似治療成功的卵巢癌患者，其實存在隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留病灶，并在初始治療后持續(xù)存在，作為隨后遠處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在來源。研究顯示，ctDNA檢測可用于監(jiān)測MRD，從而幫助評價藥物，有效消除或控制初次治療后存在的隱匿性微轉(zhuǎn)移或微小殘留病灶，從而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險[21]。多項回顧性研究表明，ctDNA可在臨床癥狀或現(xiàn)有輔助檢查證據(jù)出現(xiàn)之前識別殘留疾病患者，用于預(yù)測復(fù)發(fā)，且具有較高的敏感性和特異性[22]。Elena Pereira等研究顯示，13.7%的患者中，即使CT掃描陰性，ctDNA也能檢測到微小癌灶的存在，平均預(yù)測領(lǐng)先時間為7個月，明顯高于CT成像。且在最初治療6個月后，ctDNA檢測水平與無進展生存期和總生存期顯著改善相關(guān)。上述研究均表明了在婦科癌癥中應(yīng)用ctDNA可識別殘余腫瘤。將腫瘤組織活檢、臨床輔助檢查與基于ctDNA檢測的液體活檢結(jié)合起來，用于指導(dǎo)臨床治療和改善患者預(yù)后。通過高度精確的ctDNA檢測和定量方法，對腫瘤組織進行非侵入性的監(jiān)測，能比現(xiàn)有臨床監(jiān)測更早地檢測到殘余疾病，且腫瘤的體積、代謝和增殖率均與血漿中ctDNA數(shù)量正相關(guān)，以及基于腫瘤基因組景觀進行實時評估和個性化治療來改變臨床預(yù)后[23]。研究發(fā)現(xiàn)，體液中ctDNA檢測也有作為癌癥治療后檢測殘余病灶的潛力。最終，將MRD的ctDNA分析應(yīng)用到臨床工作中，指導(dǎo)個體化治療和改善化療患者預(yù)后[23]。

4 ctDNA檢測在卵巢癌中面臨的挑戰(zhàn)

液體活檢ctDNA越來越多地被應(yīng)用于腫瘤學(xué)中，然而，它們的使用僅限于臨床研究。因此需在應(yīng)用于臨床之前對液體活檢進行更多的臨床前研究。目前大量研究顯示，大多數(shù)液體活檢檢測缺乏臨床有效性的證據(jù)，特別是在臨床應(yīng)用方面?，F(xiàn)在大多數(shù)分析方法集中于血漿這單一分析物上，但通過采用多參數(shù)分析方法，結(jié)合來自血液樣本中存在的多個分析物的數(shù)據(jù)，可以提高分辨率。此外，還可通過腹水、腹腔沖洗液、初次活檢組織中的分析物，共同提高分辨率。未來液體活檢的發(fā)展預(yù)計將覆蓋一系列學(xué)科，包括基礎(chǔ)生物學(xué)和生理學(xué)、分子生物學(xué)和分析技術(shù)、統(tǒng)計學(xué)等。最重要的是，分析開發(fā)人員必須要遵循監(jiān)管指導(dǎo)來建立分析性能和分析有效性。只有在臨床有效性和臨床效用被證明之后，液體活檢才能充分發(fā)揮其潛力，并對卵巢癌患者的臨床管理產(chǎn)生預(yù)期的影響[24]。

5 結(jié)論

目前，找到有效的卵巢癌早期檢測工具仍是診斷和治療卵巢癌疾病中最重要的環(huán)節(jié)之一。現(xiàn)在ctDNA主要作為輔助檢測，并不能取代金標準組織活檢。早期診斷卵巢癌以及評價卵巢癌的治療反應(yīng)、指導(dǎo)用藥，將大大改善患者的預(yù)后，提高生存率。ctDNA有望成為癌癥篩查、診斷、預(yù)后評估、藥物反應(yīng)監(jiān)測和疾病監(jiān)測的重要臨床工具。但ctDNA早期疾病檢測的準確性、高實施成本、克隆造血的混淆有待進一步臨床實用研究。