轉(zhuǎn)BpTCP10基因抑制表達(dá)白樺的耐鹽性分析

李芳蕊，許思佳，劉霽廣，向泓霖，張家偉，崔帥，丁一淇，李慧玉

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor）又稱(chēng)反式作用因子，能夠在植物細(xì)胞代謝、器官構(gòu)成及環(huán)境應(yīng)答等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了眾多植物轉(zhuǎn)錄因子家族，主要有NAC、WRKY、MYB、AP2/EREBP、bHLH等[1]。隨著研究的不斷深入，bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子的更多功能也逐步被發(fā)現(xiàn)。TCP家族基因?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄因子的一類(lèi)，也是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，具有保守的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，廣泛參與到植物的細(xì)胞增殖分化、器官形態(tài)建成、光形態(tài)建成及衰老等生物學(xué)過(guò)程[2-12]。TCP家族成員均含有一個(gè)由59 個(gè)氨基酸殘基組成的保守結(jié)構(gòu)域，且根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的差別，TCP家族基因分為Class I（PCF 類(lèi)）和Class II（CIN 和CYC/TB1）兩類(lèi)[13]。Class I類(lèi)基因功能在草本植物中研究得較為深入，在擬南芥Arabidopsis thaliana中，Class I 亞類(lèi)的AtTCP14和AtTCP15基因共同參與了葉形和節(jié)間發(fā)育的調(diào)控，AtTCP20參與調(diào)控細(xì)胞的增大、分裂以及分化，同時(shí)AtTCP21是植物生物鐘的重要組成部分[14]。MicroRNAs 是廣泛存在于生物界的非編碼單鏈RNA，通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)量來(lái)改變植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。在楊樹(shù)中，PtmiR393靶向調(diào)控楊樹(shù)FBL家族基因，影響植物體的生命活動(dòng)[15]。MicroRNA319（miR319）已被證明能夠靶向調(diào)控TCP基因。在葡莖剪股穎Agrostis stolonifem中，miR319a過(guò)表達(dá)植株中靶基因AsPCF5/6/8/14下調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出抗旱和耐鹽性增強(qiáng)[16]。水稻Oryza sativa中，OsPCF2通過(guò)啟動(dòng)OsNHX1的表達(dá)來(lái)響應(yīng)鹽和PEG 脅迫[17]。OsPCF6和OsTCP21通過(guò)清除活性氧(ROS)，提高了水稻的耐寒性[18]。OsTCP19與ABA 信號(hào)通路基因OsABI4和OsULT1相互作用，參與植物非生物脅迫響應(yīng)[19]。在茶樹(shù)Camellia sinensis中，CsTCP轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用，推測(cè)其可能通過(guò)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)[20]。在香鱗毛蕨Dryopteris fragrans中的研究也得出了類(lèi)似結(jié)論[21]。

白樺Betula platyphylla是在東北地區(qū)廣泛分布的用材樹(shù)種，但耐鹽能力低，而東北地區(qū)未來(lái)的造林地多為干旱半干旱、且鹽漬化程度較高的地區(qū)。白樺也是我國(guó)北方主要城市綠化樹(shù)種，但融雪劑引起的土壤鹽漬，嚴(yán)重影響了白樺的生長(zhǎng)及綠化效果。TCP家族基因產(chǎn)物間常形成同源或異源二聚體。酵母雙雜交結(jié)果表明，BpTCP10 蛋白可分別與多個(gè)TCP家族的其他成員（BpTCP1、BpTCP2、BpTCP4、BpTCP7、BpTCP9、BpTCP11）的蛋白發(fā)生相互作用[22]，形成二聚體，故而推測(cè)BpTCP10基因是揭示TCP家族基因功能的核心。本研究以白樺為試材，在克隆TCP家族基因PCF 亞類(lèi)中的BpTCP10基因的基礎(chǔ)上，研究該基因的表達(dá)特性；同時(shí)構(gòu)建植物抑制表達(dá)載體，進(jìn)行白樺遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)轉(zhuǎn)基因白樺株系進(jìn)行耐鹽性分析。探討該基因在白樺生長(zhǎng)發(fā)育及耐鹽方面的功能，為培育耐鹽白樺良種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

選取東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種試驗(yàn)基地的10年生已開(kāi)花結(jié)實(shí)的野生型歐洲白樺植株，5—9月間，每隔15 天取白樺雄花序、葉片、嫩莖、頂芽的材料一次。因雄花序越冬宿存，次年繼續(xù)發(fā)育，而雌花序次年4月發(fā)育，當(dāng)年成熟。故于次年4月，每隔5 天摘取雄花序和雌花序，用于提取RNA，進(jìn)行BpTCP10基因組織部位表達(dá)特性分析。

對(duì)從白樺育種基地采集的全同胞家系種子進(jìn)行水培，待長(zhǎng)出兩片子葉后，選取大小一致的幼苗分別平鋪在涂有相應(yīng)激素和非生物脅迫處理試劑的WPM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中分別加入1 μmol/L ME-JA、0.1 mol/L ABA、20% PEG600、0.4 mol/L NaCl、0.15 mol/L CdCl2、0.3 mol/L NaHCO3[22]。分別在處理0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)行取材。每種激素與非生物脅迫試劑均處理幼苗120 株，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集20 株，經(jīng)液氮速凍，放入-80℃冰箱存放，用于提取RNA，研究BpTCP10基因?qū)τ诩に丶胺巧锩{迫的應(yīng)答分析。

BpTCP10基因抑制表達(dá)白樺株系及對(duì)照株系生根移栽后2 個(gè)月，各株系內(nèi)分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的植株各10 株，取第4～7 片成熟葉，采用植物葉盤(pán)打孔器法[23-24]。打孔取直徑為10 mm 的葉盤(pán)。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定對(duì)離體葉片進(jìn)行NaCl 脅迫的最適濃度。將葉盤(pán)置于含有最適NaCl濃度的WPM 液體培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置15片，于組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，并于0、12 及24 h取材進(jìn)行染色及生理指標(biāo)測(cè)定。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2 BpTCP10 基因的克隆及序列分析

根據(jù)白樺轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計(jì)BpTCP10基因的ORF 序列特異引物（表1），以白樺葉片cDNA為模板，擴(kuò)增BpTCP10基因的ORF 序列，并通過(guò)Gateway 技術(shù)構(gòu)建到入門(mén)載體pENTR 上，通過(guò)PCR 及測(cè)序確定基因序列的準(zhǔn)確性。

利用NCBI 上的在線尋找程序（ORF Finder）確定本序列的ORF；對(duì)蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)進(jìn)行在線計(jì)算（http://web.expasy.org/protparam/）；用Blastx 進(jìn)行同源序列比對(duì)，搜索擬南芥A.thaliana、水稻O.sativa、玉米Z.mays及毛果楊P.trichocarpa中的TCP基因家族PCF亞類(lèi)同源基因的氨基酸序列，并利用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，分析bHLH 結(jié)構(gòu)域；使用上述基因的蛋白全長(zhǎng)序列，借助MEGA 5.1 軟件的Neighbor-Joining 算法，1 000 次重復(fù)，以默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。從歐洲白樺基因組網(wǎng)站（https://genomevolution.org/CoGe/GenomeInfo.pl?gid=35080）中獲得BpTCP10啟動(dòng)子序列，使用PLACE 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行元件預(yù)測(cè)和分析。

1.3 qPCR 分析

使用RNA 提取試劑盒（Biotec，北京）提取白樺不同組織部位、激素及脅迫處理后（見(jiàn)1.1 植物材料與脅迫處理部分）幼苗及生根移栽兩個(gè)月后，BpTCP10抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系葉片的總RNA。采用ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Toyobo）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 后稀釋10 倍作為模板，采用SYBR? Premix ExTaqTM Ⅱ（TAKARA） 試劑盒進(jìn)行qPCR。BpTCP10基因引物序列參見(jiàn)表1。選用18sRNA 作為內(nèi)參基因（上下游引物分 別 為5′-ATCTTGGGTTGGGCAGATCG-3′，5-CATTACTCCGATCCCGAAGG-3′），反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸34 s（40 個(gè)循環(huán)），繪制溶解曲線的溫度為95℃持續(xù)15 s，60℃持續(xù)1 min，95℃持續(xù)15 s。qPCR 在ABI PRISM? 7500 熒光定量PCR 儀上完成，所有樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用-ΔΔCt 方法進(jìn)行基因的相對(duì)定量分析。

1.4 BpTCP10 基因植物抑制表達(dá)載體構(gòu)建和白樺遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)PCR 將BpTCP10基因的C 末端附加一段EAR 序列的抑制結(jié)構(gòu)域（引物序列參見(jiàn)表1），使用雙酶切技術(shù)將BpTCP10-SRDX 構(gòu)建到以CAMV 35S 為啟動(dòng)子的pCAMBIA1300 載體上，通過(guò)PCR 及測(cè)序確定基因序列的正確性。構(gòu)建好的pCAMBIA1300-BpTCP10-SRDX 載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行白樺遺傳轉(zhuǎn)化[25]。獲得的抗性植株通過(guò)PCR及qPCR 分析外源基因是否整合及其表達(dá)情況。轉(zhuǎn)pCAMBIA1300 空載體的植株目的基因表達(dá)量與野生型并無(wú)顯著差異[25]，故本研究采用野生型作為對(duì)照。

表1 白樺BpTCP10 克隆、抑制表達(dá)載體構(gòu)建及定量PCR 引物序列Table 1 PCR primers used of Betula platyphylla BpTCP 10

1.5 DAB，NBT 染色及SOD，H2O2 的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫試劑盒分別測(cè)定SOD，H2O2。參考寧坤等[27]方法進(jìn)行DAB 及NBT 染色。分別以0 h 時(shí)野生型株系的指標(biāo)作為對(duì)照，材料、處理參數(shù)、時(shí)間及取材見(jiàn)1.1 植物材料與脅迫處理部分。每個(gè)指標(biāo)均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpTCP10 基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中BpTCP10基因序列信息設(shè)計(jì)特異引物，以白樺葉片總RNA 為模板，克隆獲得白樺BpTCP10基因的ORF 序列。生物信息學(xué)分析表明，BpTCP10基因的ORF 長(zhǎng)度為813 bp，編碼270 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為27 893.06 D，理論等電點(diǎn)為9.51。分別對(duì)屬于TCP 基因家族PCF 亞類(lèi)的2 條擬南芥、1 條毛果楊及BpTCP10基因，以及CIN 亞類(lèi)的1 條擬南芥基因和1 條毛果楊基因的保守結(jié)構(gòu)域部分的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：BpTCP10基因與其他物種PCF 亞類(lèi)基因的氨基酸序列均含有TCP保守結(jié)構(gòu)域bHLH，不含有CIN 亞類(lèi)的特有4 個(gè)氨基酸殘基[28]，也沒(méi)有R 結(jié)構(gòu)域和谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 白樺BpTCP10 與其他物種TCP 基因bHLH 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequences alignment between Betula platyphylla BpTCP10 and the bHLH domain of other species

利用MEGA5.1，選取擬南芥、水稻、玉米及毛果楊的PCF 亞類(lèi)基因的氨基酸序列與白樺BpTCP10氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2所示，BpTCP10屬于PCF 亞類(lèi)，與擬南芥AtTCP11基因具有一定的相似性。

圖2 白樺BpTCP10 與其他物種PCF 亞類(lèi)基因的進(jìn)化關(guān)系分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of BpTCP10 and other PCF subclass genes

使用PLACE 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行元件預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，BpTCP10啟動(dòng)子中包含有多個(gè)激素響應(yīng)及脅迫響應(yīng)元件（表2）。激素響應(yīng)元件包括：赤霉素響應(yīng)相關(guān)元件（GARE1OSREP1，P-box，WRKY71OS）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（CATATGGMSAUR，NTBBF1ARROLB）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（T/GBOXATPIN2）和脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，DPBFCOREDCDC3，DRE2COREZMRAB17，MYB1AT，MYB2CON SENSUSAT）等；脅迫相關(guān)元件包括：低溫響應(yīng)元件（LTRECOREATCOR15），干旱響應(yīng)元件（MARTBOX，MBS），防御和脅迫應(yīng)答元件（TC-rich repeats），誘導(dǎo)物應(yīng)答元件（W box）及傷害響應(yīng)元件（WBOXATNPR1，WBOXNTERF3）等，說(shuō)明該基因可能參與相應(yīng)的激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)。

表2 白樺BpTCP10 基因啟動(dòng)子序列順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Prediction results of the cis-acting elements of BpTCP10 promoter

2.2 白樺BpTCP10 基因響應(yīng)激素處理及非生物脅迫脅迫應(yīng)答分析

參考BpTCP10基因啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇相應(yīng)的激素和非生物脅迫對(duì)野生型白樺幼苗進(jìn)行處理，分析其表達(dá)特性。如圖3所示，在ABA處理過(guò)程的中，BpTCP10基因的表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，在2 h 時(shí)BpTCP10表達(dá)量達(dá)到最高，為0 h的27倍，在12 h 后達(dá)到最低水平，下調(diào)表達(dá)達(dá)到2-6倍；BpTCP10在JA 處理過(guò)程中始終呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，在處理4 h 時(shí)達(dá)到最低，為2-7倍，此后表達(dá)量逐漸升高，但均低于0 h 時(shí)的表達(dá)量。

圖3 不同激素及脅迫處理后各時(shí)間點(diǎn)白樺幼苗BpTCP10 基因的表達(dá)量Fig.3 Expression of BpTCP10 in B.platyphylla seedlings at different time points after the treatment with different hormones and stress

采 用CdCl2、NaCl、NaHCO3、PEG 4 種脅迫處理白樺幼苗，分析在不同非生物脅迫下BpTCP10的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在CdCl2脅迫下，BpTCP10的表達(dá)始終呈現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)，在12 h 時(shí)達(dá)到最低，為2-4倍；在NaCl 脅迫中，整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，4 h 時(shí)表達(dá)量下調(diào)至低于0 h 時(shí)的水平，6 h 時(shí)最低，但未達(dá)到顯著水平（＜2 倍）；NaHCO3脅迫下，BpTCP10的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，2 h 時(shí)表達(dá)量最高，接近24倍，12 h 時(shí)下調(diào)表達(dá)最為顯著，達(dá)到2-9倍。PEG 脅迫下，BpTCP10的表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，2 h 時(shí)上調(diào)表達(dá)最高，接近26倍，之后表達(dá)量下調(diào)，24 h 時(shí)下調(diào)表達(dá)最為顯著，達(dá)到2-10倍。

2.3 BpTCP10 基因組織表達(dá)特性分析

以各部位中BpTCP10基因在6月1日的表達(dá)量為對(duì)照，分析BpTCP10基因在一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)各組織部位中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在葉中，初期BpTCP10基因的表達(dá)量變化不明顯（＜2 倍），而在8月1日表達(dá)量顯著下調(diào)，為2-2倍，在8月15日上調(diào)達(dá)到峰值，接近25倍；在莖節(jié)中，BpTCP10表達(dá)量整體呈現(xiàn)初期無(wú)變化，后期下調(diào)的趨勢(shì)，尤其在9月1日和8月15日，表達(dá)量下調(diào)達(dá)到峰值（2-5倍）；在頂芽中，BpTCP10基因整體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其中，在9月1日的下調(diào)表達(dá)最為顯著，達(dá)到2-6倍。在雄花序發(fā)育初期及4月30日，BpTCP10基因上調(diào)表達(dá)；其他時(shí)間點(diǎn)均主要呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。在雌花序中，BpTCP10基因在4月25日和4月30日呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在4月25日表達(dá)量最高，為23倍（圖4）。

圖4 BpTCP10 基因在白樺各組織部位的表達(dá)量Fig.4 Expression of BpTCP10 in different tissues of B.platyphylla

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

為了探究白樺BpTCP10的功能，本研究構(gòu)建了35S::BpTCP10-SRDX 抑制表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行白樺遺傳轉(zhuǎn)化。通過(guò)潮霉素篩選，最終獲得了6 個(gè)抑制表達(dá)株系。使用載體及基因引物對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，抑制表達(dá)株系在849 bp 這一目標(biāo)位置產(chǎn)生條帶，而陰性對(duì)照未見(jiàn)條帶，表明外源基因已成功整合至基因組中。通過(guò)qPCR 分析轉(zhuǎn)基因株系的BpTCP10基因表達(dá)量，結(jié)果顯示，6 個(gè)抑制表達(dá)株系中，除RTCP10-4 及RTCP10-5 外，其他4 個(gè)株系中BpTCP10的表達(dá)量均低于對(duì)照株系，其中，RTCP10-6 株系的BpTCP10基因下調(diào)表達(dá)最明顯，達(dá)到了2-8倍（圖5），其次為RTCP10-1和RTCP10-2。

圖5 BpTCP10 抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的獲得Fig.5 Acquisition of transgenic lines with inhibited BpTCP10 expression

2.5 BpTCP10 基因?qū)Π讟迳L(zhǎng)發(fā)育的影響

調(diào)查移栽2 個(gè)月的苗木生長(zhǎng)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各株系間的苗高及地徑均達(dá)到差異極顯著的水平（P＜0.05）。轉(zhuǎn)基因株系的苗高、地徑均明顯低于對(duì)照，尤其是RTCP10-2 及RTCP10-3 株系，其苗高和地徑分別比對(duì)照株系低了21.6%、30.8%和9.5%、20.8%，轉(zhuǎn)基因株系的平均葉面積與對(duì)照株系相比沒(méi)有明顯差異（圖6）。

圖6 轉(zhuǎn)BpTCP10 抑制表達(dá)白樺株系與對(duì)照白樺的形態(tài)學(xué)分析Fig.6 Morphological analysis of transgenic lines with inhibited BpTCP10 expression and the control seedlings

2.6 BpTCP10 影響白樺的耐鹽能力

細(xì)胞中H2O2釋放出的氧離子能夠氧化DAB，形成棕色沉淀。H2O2的含量越高，表明細(xì)胞受損越嚴(yán)重，染色就越深。NBT 能夠被超氧離子O2-氧化形成藍(lán)色的甲腙，甲腙顏色的深淺也能夠反映出O2-含量的多少，超氧離子含量越高表明細(xì)胞受損越嚴(yán)重，葉片染色程度也越深[29]。

定量分析發(fā)現(xiàn)白樺BpTCP10基因響應(yīng)NaCl脅迫應(yīng)答，以BpTCP10抑制表達(dá)白樺株系的離體葉片為材料，預(yù)試驗(yàn)后，選取0.8%NaCl 進(jìn)行脅迫處理，通過(guò)DAB 和NBT 染色分析轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽能力。結(jié)果表明，隨著NaCl 脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因及對(duì)照株系的DAB 染色均呈現(xiàn)不同程度的加深。但轉(zhuǎn)基因株系的染色深于對(duì)照株系，尤其是RTCP10-2 株系，在脅迫過(guò)程中著色最重。NBT染色結(jié)果與DAB 結(jié)果相近，RTCP10-2 出現(xiàn)了最多的藍(lán)色斑塊，脅迫處理24 h 后，RTCP10-2 染色程度仍舊最深。BpTCP10抑制表達(dá)白樺株系表現(xiàn)為鹽敏感，這表明BpTCP10基因在耐鹽過(guò)程中可能起到了一定的作用（圖7）。

圖7 0.8% NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的DAB 和NBT 染色結(jié)果Fig.7 DAB and NBT staining analysis of the transgenic lines treated with 0.8% NaCl

H2O2是信號(hào)物質(zhì)，也是強(qiáng)氧化物，H2O2的含量也能夠反應(yīng)出細(xì)胞受損的程度。SOD 具有維持活性氧代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能。當(dāng)細(xì)胞的SOD 含量降低，不能有效地清除超氧離子，則容易引發(fā)氧化性破壞作用[28]。

本研究測(cè)定了轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫過(guò)程中H2O2及SOD 含量變化，進(jìn)一步探討B(tài)pTCP10基因在抗鹽過(guò)程中的功能。0 h 時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系間的H2O2含量差異并不顯著；處理12 及24 h 后，轉(zhuǎn)基因株系的H2O2含量均顯著高于對(duì)照株系，尤其是RTCP10-2 株系，在整個(gè)脅迫過(guò)程中的H2O2含量最高，處理12 h 的含量為對(duì)照株系的1.91 倍，24 h 為1.33 倍（圖8）。SOD 的活性測(cè)定結(jié)果表明，0 及12 h 時(shí)，各株系SOD 活性差異并不顯著，而24 h 時(shí)，除RTCP10-2 株系外，其他各株系的SOD 活性均有升高，但轉(zhuǎn)基因株系的SOD 活性與對(duì)照差異不顯著或低于對(duì)照，尤其是RTCP10-2 株系，12 和24 h 時(shí)SOD 的含量分別為對(duì)照株系的87.4% 和57.4%（圖8）。由此可以推斷，BpTCP10基因在植物鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中，很可能參與了對(duì)細(xì)胞膜透性和過(guò)氧化物代謝的調(diào)控，從而影響了植物的耐鹽能力。

圖8 0.8% NaCl 脅迫下不同時(shí)間不同株系的H2O2 和SOD 含量Fig.8 H2O2 and SOD contents during the 0.8% NaCl treatment

3 結(jié) 論

BpTCP10屬于TCP轉(zhuǎn)錄因子家族中的PCF亞類(lèi)，與擬南芥AtTCP11有一定的相似性；BpTCP10基因在葉、莖、頂芽、雄花序及雌花序中均有表達(dá)，尤其是在葉片中表達(dá)量最高，對(duì)BpTCP10抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行NaC1 脅迫處理后，H2O2含量、SOD 含量、NBT 及DAB 染色結(jié)果均表明轉(zhuǎn)BpTCP10基因在一定程度上影響了白樺的耐鹽性。

4 討 論

系統(tǒng)發(fā)育分析中的相似性越高，基因之間的功能就可能越接近。PCF 亞類(lèi)基因的聚類(lèi)分析表明，白樺BpTCP10與擬南芥AtTCP11聚到一個(gè)分支。而AtTCP11與AtTCP20存在功能冗余[30]，在擬南芥中，AtTCP20參與了葉細(xì)胞的生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)過(guò)程，并且調(diào)節(jié)其他有關(guān)葉發(fā)育的基因[31]。本研究通過(guò)qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，BpTCP10在莖、葉以及雄花序發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量有著顯著變化，可以推斷，白樺BpTCP10在植物體這些組織部位的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中也起到一定的作用，BpTCP10在莖、頂芽和雄花序中整體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，而在葉和雌花序中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)在植物不同組織部位的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，BpTCP10基因起到的功能是不同的，至于BpTCP10調(diào)控植物體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的具體作用和機(jī)制，則需要進(jìn)一步的研究來(lái)進(jìn)行揭示。

本研究獲得的6 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，有4 個(gè)株系中的BpTCP10基因的表達(dá)量均下調(diào)（RTCP10-1，RTCP10-2，RTCP10-3，RTCP10-6），但因RTCP10-6 株系的苗木數(shù)量沒(méi)有達(dá)到符合試驗(yàn)要求的小樣本量，所以并未選取這個(gè)株系進(jìn)行相應(yīng)分析，故選取RTCO10-1，RTCP10-2，RTCP10-3 這3 個(gè)株系進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。在對(duì)這3個(gè)株系進(jìn)行表型分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)RTCP10-1 株系中BpTCP10基因的下調(diào)表達(dá)最為顯著，但是苗高地徑的減少較小；RTCP10-3株系中BpTCP10基因下調(diào)表達(dá)最不顯著，但是苗高及地徑的變化最大。這可能是因?yàn)門(mén)CP家族基因間存在功能冗余[32]導(dǎo)致的。Danisman 等[33]的報(bào)道中表明，在擬南芥中，AtTCP9 蛋白和AtTCP20 蛋白存在功能冗余，這兩類(lèi)蛋白均通過(guò)茉莉酸信號(hào)通路共同調(diào)控葉的生長(zhǎng)。此外，AtTCP14和AtTCP15在調(diào)控?cái)M南芥節(jié)間發(fā)育過(guò)程中存在功能冗余[14]。AtTCP6，AtTCP11及AtTCP20之間存在功能冗余[29]。在進(jìn)化關(guān)系分析的結(jié)果中，雖然BpTCP10與AtTCP11聚到同一個(gè)分枝，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且木本植物與草本植物之間，TCP家族基因行使的功能和途徑也可能有所差別，此外，TCP 蛋白也可與多種非TCP 蛋白相互作用，參與調(diào)控為數(shù)眾多的生命活動(dòng)進(jìn)程[34]。因此，我們推測(cè)雖然在轉(zhuǎn)BpTCP10基因株系生長(zhǎng)過(guò)程中，BpTCP10基因被抑制，但可能存在功能冗余的部分基因和通路共同調(diào)控莖的發(fā)育。這些基因的作用機(jī)理需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。

此外，TCP家族轉(zhuǎn)錄因子參與了一系列的植物防御反應(yīng)[35-37]。擬南芥中，AtTCP8、AtTCP14、AtTCP15等參與了植物的脅迫響應(yīng)和免疫反應(yīng)[38,39,35]。目前，I 類(lèi)TCP基因在非生物脅迫中的參與已經(jīng)初步揭示。水稻中OsTCP14（PCF6）和OsTCP21的過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)分別顯著降低或增加植株對(duì)于寒冷的敏感性，OsTCP14（PCF6）和OsTCP21負(fù)調(diào)控冷應(yīng)激條件下ROS 介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)[18]。在非生物脅迫下，水稻OsTCP19的過(guò)表達(dá)上調(diào)了二酰甘油乙酰轉(zhuǎn)移酶DGAT1關(guān)鍵基因的表達(dá)，引起轉(zhuǎn)基因植物中脂滴（LDs）的積累，進(jìn)而提高了植物的抗旱性[19]。在對(duì)大豆Glycine max，鷹嘴豆Cicer arietinum，菜豆Phaseolus vulgaris，蒺藜苜蓿Medicago truncatula和百脈根Lotus japonicus5 種植物的研究中，大多數(shù)TCP基因在干旱脅迫下下調(diào)表達(dá)，暗示了在干旱脅迫反應(yīng)中，部分TCP基因可能具有相似的功能。這些結(jié)果表明，TCP基因在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[40]。BpTCP10基因啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)脅迫應(yīng)答元件，NaCl 脅迫處理后BpTCP10的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，推測(cè)該基因可能參與了植物的非生物脅迫應(yīng)答的過(guò)程。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的BpTCP10抑制表達(dá)白樺株系，分析轉(zhuǎn)基因株系NaCl 處理后的生理變化也發(fā)現(xiàn)，抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為鹽敏感，脅迫處理12 h 后，RTCP10-2株系的過(guò)氧化氫含量就野生型對(duì)照株系的近兩倍，24 h 時(shí)，為對(duì)照組的1.33 倍；12 h 時(shí)，RTCP10-2株系的超氧化物歧化酶含量為對(duì)照株系的87.4%，24 h 時(shí)，下降到僅為對(duì)照株系的57.4%，表明在RTCP10-2 株系中，細(xì)胞膜透性和過(guò)氧化物的代謝明顯受到了影響，說(shuō)明BpTCP10基因可能參與植物的鹽脅迫響應(yīng)，但其調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。