胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展*

陳珂彥 綜述 張 靜 丁士剛 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科，北京 100191)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，2020年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)的癌癥發(fā)病率，胃癌位列全球第5位[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最常見的轉(zhuǎn)移形式，早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為4.1%～35.8%[2～4]。隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)越來越多地應(yīng)用于早期胃癌患者。ESD應(yīng)用的前提是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，正確評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)十分重要。淋巴結(jié)陰性的部分患者胃癌根治術(shù)后短期內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，有學(xué)者認(rèn)為這一現(xiàn)象和淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移(lymph nodes micro-metastasis，LNM)有關(guān)。HE染色中分級(jí)為pN0患者中LNM檢測陽性占10%～30%[5]。近年來，LNM對胃癌預(yù)后和治療方面的影響逐漸受到重視但仍存在爭議，本文就LNM的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行文獻(xiàn)總結(jié)，探討LNM的發(fā)現(xiàn)對早期胃癌治療策略的影響。

1 胃癌LNM概述

根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Cancer Control，AJCC)第8版[6]惡性腫瘤分期，孤立腫瘤細(xì)胞(isolated tumor cells，ITCs)和 LNM均屬于隱匿腫瘤細(xì)胞(occult tumor cells, OTCs)。OTCs即為常規(guī)HE染色難以發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞簇。ITC定義為最大直徑<0.2 mm的腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞簇，LNM定義為腫瘤細(xì)胞簇最大直徑超過0.2 mm或腫瘤細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)，并且最大直徑不超過2 mm者。AJCC第8版惡性腫瘤分期延續(xù)了第7版的觀點(diǎn)，即組織學(xué)上證實(shí)ITC記為pN0(i+)，LNM記為pN1(mi)，若組織學(xué)檢查為陰性而逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測陽性，則記為pN0(mol+)[7]。

2 LNM的常見檢測方法

2.1 連續(xù)切片法

目前,臨床上常用的檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的方法是將淋巴結(jié)沿縱軸切開進(jìn)行常規(guī)HE染色，這種檢測可能會(huì)遺漏13.1%～20%的LNM[2,8]。連續(xù)切片法為最早嘗試提高LNM檢出率的檢測方法，隨著送檢切片寬度減小，檢出率也隨之提高[9]。此種方法對設(shè)備要求較低，但是單獨(dú)使用此法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測效率低下。因此，研究者多選擇將連續(xù)切片法與免疫組化(immunohistochemical staining，IHC)等方法聯(lián)合使用，在提高檢測率的同時(shí)兼顧檢測的經(jīng)濟(jì)性。

2.2 IHC

由于IHC相比HE染色法能更靈敏地檢測出LNM[10～12]，目前已成為研究胃癌LNM的一種重要檢測手法，常用的標(biāo)志物有癌胚抗原(CEA)，細(xì)胞角蛋白CK(AE1/AE3)、CK(CAM5.2)、CK-19等。IHC最突出的優(yōu)點(diǎn)就是在保證一定靈敏度的同時(shí)兼顧經(jīng)濟(jì)性，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，可以在鏡下直觀地評估腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞簇的形態(tài)和直徑，但與RT-PCR相比，靈敏度稍低，且由于IHC是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測，結(jié)果易受到實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)條件的影響。

2.3 RT-PCR

與IHC相比，將RT-PCR用于LNM狀態(tài)的檢測使檢測靈敏度大大提高，且所需樣本更少，即使107個(gè)細(xì)胞中僅有1個(gè)腫瘤細(xì)胞，使用RT-PCR也能將其檢出[9]。由于尚未發(fā)現(xiàn)胃腸道惡性腫瘤特異的基因，目前主要采用在多個(gè)惡性腫瘤中均表達(dá)的CEA和CK這幾種基因進(jìn)行LNM檢測。雖然不同研究得出的LNM檢出率存在差異，但使用RT-PCR的檢出率多為27%以上[13]。雖然RT-PCR有更高的靈敏度，但結(jié)果也可能出現(xiàn)假陽性和假陰性，常見的假陽性原因主要是基因的不正確轉(zhuǎn)錄，生物標(biāo)本污染，操作水平受限等，而標(biāo)記基因的異質(zhì)表達(dá)可能造成假陰性。RT-PCR對設(shè)備和實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求高于前2種檢測方法，通過這種方法無法鏡下觀察到陽性細(xì)胞，因此，無法測量引起RT-PCR陽性反應(yīng)的細(xì)胞的大小或評估其形態(tài)，無法判斷是LNM還是ITC，ITC在胃癌患者預(yù)后上的意義尚不明確，因此，可能影響醫(yī)師對治療策略的制定。盡管RT-PCR法有上述缺點(diǎn)，但高靈敏度依然使其作為研究上使用較廣的檢測LNM的技術(shù)手段之一。

2.4 一步核酸擴(kuò)增法(one step nucleic acid amplification，OSNA)

OSNA最早是由Tsujimoto等[14]提出用于乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的一種術(shù)中檢測手段，是基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行的全自動(dòng)半定量核酸測定方法，通過檢測CK19 mRNA表達(dá)來判定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)。Shimada等[15]報(bào)道以CK19 mRNA 250 拷貝數(shù)/μl為截?cái)嘀禃r(shí)，OSNA和術(shù)后病理切片一致率為0.97，靈敏度為0.636，特異度為0.988。OSNA檢測陰性但病理檢測陽性的標(biāo)本多由于CK19 mRNA在標(biāo)本上分布偏倚以及在某些類型胃癌中低表達(dá)所致，meta分析顯示OSNA的診斷比值比(diagnostic odds ration，DOR)可達(dá)275.14[16]。以上研究均證實(shí)OSNA可用于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的術(shù)中檢測。

OSNA具有靈敏度高，檢測時(shí)間短的優(yōu)勢，可在30 min完成1枚淋巴結(jié)的檢測，50 min內(nèi)完成4枚淋巴結(jié)的檢測，世界范圍內(nèi)已有290家醫(yī)院采用OSNA作為術(shù)中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)檢測的手段[15,17]。OSNA的結(jié)果受限于CK19 mRNA的表達(dá)。在某些分化較差的胃癌如印戒細(xì)胞癌，Lauren分型混合型等胃癌中CK19mRNA低表達(dá)，可能出現(xiàn)假陰性，因此，對于采用OSNA檢測的患者建議術(shù)前進(jìn)行CK19 mRNA表達(dá)的評估，CK19mRNA高表達(dá)的患者對于此種檢測手段獲益更大[15,18]。

3 LNM檢測的臨床意義

3.1 影響胃癌TNM分期

雖然在第7版AJCC腫瘤分期已將LNM定義為pN1(mi)，提出LNM應(yīng)當(dāng)被納入TNM分期進(jìn)行考慮，但目前是否將LNM納入TNM分期，以及以何種標(biāo)準(zhǔn)納入尚無明確定論。根據(jù)第8版AJCC的TNM分期，當(dāng)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移超過15枚均屬于N3b，在這種情況下，新發(fā)現(xiàn)的LNM并不會(huì)對分期再造成影響。但當(dāng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不超過15枚時(shí)，新發(fā)現(xiàn)的LNM可能會(huì)造成腫瘤分期的上調(diào)。Santos等[5]對51例胃癌切除的淋巴結(jié)采用AE1和AE3標(biāo)記進(jìn)行免疫熒光染色，重新分期，29.4%(15/51)的患者N分期以及23.5%(12/51)患者的腫瘤分期發(fā)生改變；原分級(jí)為pN0期的患者，有19.2%(5/26)的患者N分期及腫瘤分期均發(fā)生改變；原分級(jí)為pN1或者更高級(jí)別的患者中，40.0%(10/25)的患者發(fā)生N分期改變，28.0%(7/25)的患者腫瘤分期發(fā)生改變。有LNM的患者臨床預(yù)后更差，與不存在LNM的同一分期患者相比復(fù)發(fā)率更高、總體生存率更低[19,20]。TNM作為指導(dǎo)疾病治療以及提示患者預(yù)后的重要參考，應(yīng)盡早統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，明確是否需要將LNM納入TNM分期。

3.2 LNM與臨床病理特征之間的關(guān)系

自LNM的概念被提出之后，各個(gè)實(shí)體瘤領(lǐng)域進(jìn)行大量研究來探究LNM與哪些臨床病理特征相關(guān)。Li等[21]回顧172例根治性胃切除術(shù)聯(lián)合D2淋巴結(jié)清掃被分級(jí)為pN0的患者，單因素分析顯示LNM與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴管浸潤、Lauren分型為彌漫性均顯著相關(guān)，多因素分析顯示分化程度差(OR=1.266，95%CI：4.274～37.037，P=0.013)、淋巴管浸潤(OR=2.178, 95%CI：1.635～6.327，P=0.009)、浸潤深度大(OR=3.755，95%CI：1.716～8.218，P=0.004)以及TNM分期較差(OR=3:152，95%CI：1.547～7.589，P=0.002)為LNM發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Lou等[19]研究106例T1N0早期胃癌，其中22例(20.8%)檢出LNM，進(jìn)一步分析顯示，LNM的發(fā)生與浸潤深度(P=0.039)及淋巴管浸潤(P=0.009)顯著相關(guān)，且14例黏膜內(nèi)癌切除的淋巴結(jié)均未發(fā)現(xiàn)LNM。葉嬋娟等[12]對73例pN0胃癌進(jìn)行研究，結(jié)果顯示LNM的發(fā)生與分化類型(P<0.001)和淋巴管浸潤(P=0.044)顯著相關(guān)。目前，淋巴管浸潤與LNM的發(fā)生相關(guān)已得到共識(shí)，其他LNM的危險(xiǎn)因素尚無統(tǒng)一定論。因此，Zeng等[22]建議對于進(jìn)展期胃癌，且出現(xiàn)一些提示預(yù)后不好的臨床特征如血管淋巴管浸潤、分化程度差的情況時(shí)，應(yīng)增加送檢淋巴結(jié)的切片數(shù)并使用IHC對淋巴結(jié)狀態(tài)進(jìn)行檢測。

3.3 LNM對預(yù)后的影響

LNM對胃癌患者預(yù)后影響方面的研究結(jié)果各異。Zeng等[22]對2014年之前開展的12項(xiàng)隊(duì)列研究進(jìn)行meta分析，與LNM陰性患者相比，LNM陽性患者復(fù)發(fā)率更高，5年生存率更低。葉嬋娟等[12]對2010年1月～2015年1月收治的pN0期胃癌進(jìn)行隨訪，LNM組生存率顯著低于OTC陰性組，多因素回歸分析顯示LNM是影響患者生存率的獨(dú)立因素(RR=2.37，95%CI：1.47～3.97，P=0.001)。Yamamoto等[23]報(bào)道以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞簇直徑1500 μm作為截?cái)嘀担?xì)胞簇直徑<1500 μm的LNM者比>1500 μm的LNM者預(yù)后更好，5年生存率分別為0.768、0.528(P=0.012)。Morgagni等[24]在300例中觀察到30例LNM(10%)，但LNM陽性組與陰性組總生存期差異無顯著性(log-rankχ2=0.08，P=0.7797)。我們認(rèn)為結(jié)論差異較大的原因考慮可能有以下幾點(diǎn)：①納入的患者來自不同種族、不同年齡，基礎(chǔ)情況、機(jī)體免疫狀態(tài)相差較大，且使用的治療策略也有所不同，患者具有較大的異質(zhì)性。②目前，關(guān)于術(shù)中切除以及送檢淋巴結(jié)的數(shù)量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可能存在分期偏倚，第8版AJCC建議無論D1淋巴結(jié)清掃還是D2淋巴結(jié)清掃，術(shù)中切除并送檢超過15枚淋巴結(jié)能增加分期的準(zhǔn)確性，減少分期偏倚，但目前我國許多醫(yī)療中心送檢的淋巴結(jié)數(shù)仍難以達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 LNM對治療策略的影響

3.4.1 LNM對淋巴結(jié)清掃范圍的影響 胃切除術(shù)聯(lián)合擴(kuò)大淋巴結(jié)清掃術(shù)被認(rèn)為是進(jìn)展期胃癌以及部分發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌患者治療的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式，歐美學(xué)者認(rèn)為與D1淋巴結(jié)清掃相比，D2淋巴結(jié)清掃對預(yù)后無顯著改善，但亞洲范圍內(nèi)的研究仍建議D2淋巴結(jié)清掃作為胃癌淋巴結(jié)清掃的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式[25]。隨著對患者術(shù)后生活質(zhì)量的重視程度提高，如何決定合適的淋巴結(jié)清掃的范圍，避免過度清掃成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。不同于其他腫瘤單個(gè)前哨淋巴結(jié)活檢，胃癌前哨淋巴結(jié)引流區(qū)切除(sentinel basin dissection, SBD)將胃的淋巴結(jié)區(qū)域沿胃主要?jiǎng)用}劃分成5個(gè)區(qū)域，分別為胃左動(dòng)脈(No.1,No.7,右側(cè)2/3的No.3)，胃右動(dòng)脈(No.5, No.8a, 左側(cè)1/3的No.3)，胃網(wǎng)膜右動(dòng)脈(No.4d, No.6)，胃網(wǎng)膜左動(dòng)脈(No.4sa, No.4sb)和胃后動(dòng)脈(No.11)[8]。采用SBD代替?zhèn)鹘y(tǒng)前哨淋巴結(jié)活檢顯著提高跳躍性轉(zhuǎn)移以及LNM的檢出率[8]?；赟BD活檢進(jìn)行的手術(shù)稱為前哨淋巴結(jié)導(dǎo)航手術(shù)(sentinel node navigation surgery，SNNS)。韓國近年開展的一項(xiàng)多中心Ⅲ期臨床隨機(jī)對照研究(SENORITA)的短期結(jié)果顯示，在早期胃癌患者中SNNS的手術(shù)安全性與胃癌根治術(shù)無顯著差異，遠(yuǎn)期腫瘤安全性的評估仍需等待后續(xù)研究結(jié)果的公布[8,26,27]。

目前,許多研究表明LNM可能作為一個(gè)不良預(yù)后因素導(dǎo)致胃癌的復(fù)發(fā)率增加。Jo等[28]通過對淋巴結(jié)中出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移進(jìn)行Ki-67染色，LNM的增殖活性雖顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶(26.7% vs. 40.5%，P=0.004)，但仍高于其他腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤中LNM的增殖活性，基于此提出對于在前哨淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的LNM應(yīng)予以清除，并且需要D1+β或更大范圍的淋巴結(jié)清掃。

3.4.2 LNM對內(nèi)鏡下治療的影響 由于與傳統(tǒng)手術(shù)相比具有更少的術(shù)后并發(fā)癥以及更高的術(shù)后生活質(zhì)量等優(yōu)勢，近年來內(nèi)鏡下治療逐漸成為治療早期胃癌的主流方式之一，但無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是施行內(nèi)鏡下治療的前提[29]。如何術(shù)前評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，已有許多學(xué)者利用術(shù)前胃鏡下組織活檢中的標(biāo)志物以及血清標(biāo)志物來對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行預(yù)測[30～34]，針對LNM預(yù)測的研究則較少。Eom等[35]對71例胃癌的原發(fā)腫瘤組織及LNM標(biāo)本進(jìn)行檢測，除去無法評估的標(biāo)本后，在原發(fā)腫瘤組織中鈣黏蛋白E與上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的表達(dá)分別為97.1%(67/69)、100%(65/65)，在原發(fā)腫瘤組織和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)雙陽性率分別為100%(46/46)、98.1%(51/52)，他們認(rèn)為鈣黏蛋白E、EpCAM是早期胃癌患者LNM的潛在分子標(biāo)志物，但是否存在更有預(yù)測價(jià)值的標(biāo)志物以及如何綜合應(yīng)用已有標(biāo)志物進(jìn)行LNM的預(yù)測仍需進(jìn)一步研究。盡管LNM對預(yù)后的影響尚無定論，但若將LNM作為一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)移，對于可能出現(xiàn)LNM的患者采用內(nèi)鏡下治療可能帶來更高的復(fù)發(fā)率，影響遠(yuǎn)期生存。因此，能確定LNM發(fā)生的危險(xiǎn)因素以及發(fā)現(xiàn)預(yù)測價(jià)值更高的血清或者活檢組織標(biāo)志物對安全地實(shí)施內(nèi)鏡下治療至關(guān)重要。

4 小結(jié)與展望

LNM這一概念的提出至今已10余年，10余年間檢測手段不斷更新，也已有部分醫(yī)院開展LNM快速術(shù)中檢測，將LNM作為病理評估的一部分，但這一做法尚未得到推廣。目前，針對LNM的研究仍主要局限于回顧性研究，關(guān)于機(jī)制方面研究較少。LNM對預(yù)后的影響目前學(xué)界尚無統(tǒng)一定論。隨著LNM的生物學(xué)特性、發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及特異的分子標(biāo)志物的進(jìn)一步研究，將有望為胃癌患者提供個(gè)體化，更合適的綜合治療，獲得更好的預(yù)后。