響應(yīng)面法優(yōu)化芝麻香型白酒酒醅中阿魏酸的提取工藝

趙巧珍，孟 武 *，劉玉濤，張夢(mèng)夢(mèng)，繆坤辰，王文潔，胥鑫鈺，李小杰，崔新瑩

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 250115）

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A），也稱為3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，結(jié)構(gòu)式C10H10O4，是肉桂酸（也稱為3-苯基-2-丙烯酸，桂皮酸）的衍生物之一，是一種酚酸，最初從香阿魏中分離得到[1-2]。阿魏酸因具有強(qiáng)抗氧化[3]和抗炎[4]功能，所以能對(duì)阿茲海默癥[5]、心腦血管[6]、癌癥[7-10]等疾病的預(yù)防和治療起一定的作用。近年來(lái)，在食品與飲料行業(yè)，將阿魏酸作為健康因子的研究越來(lái)越多[11-14]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于阿魏酸的提取分離方法主要包括滲濾法[15]、CO2超臨界萃取法[16]、超聲波法[17]以及酶水解法[18]等，但有關(guān)芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸提取的研究還很有限。

我國(guó)白酒有十二大香型，其中就包括芝麻香型。芝麻香型白酒是建國(guó)后始創(chuàng)于山東的創(chuàng)新香型，并且是魯酒中的典型代表。其酒體的香氣特殊，有類似于烘焙芝麻的氣味，而這也是芝麻香命名的由來(lái)。芝麻香的獨(dú)特風(fēng)味主要是由其特殊工藝而來(lái)。芝麻香型白酒具有清蒸續(xù)糟、泥底磚窖、麩曲和大曲共用、多微共酵、高氮配料、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、發(fā)酵周期長(zhǎng)、長(zhǎng)期儲(chǔ)存的工藝特點(diǎn)[19-22]。近年來(lái)，對(duì)芝麻香型白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性的研究較多[23-27]，但對(duì)酒醅發(fā)酵過(guò)程中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。

本研究以芝麻香型白酒酒醅為研究對(duì)象，采用浸提法提取酒醅中的游離阿魏酸，以游離阿魏酸提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間以及提取溫度對(duì)酒醅中游離阿魏酸提取量的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化游離阿魏酸提取工藝，以期為芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸的提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻香型白酒酒醅（芝麻香手工釀造班組入池酒醅）：濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司。

阿魏酸（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國(guó)TEDIA天地試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1220 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；FA2004精密電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；LGJ-18A真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；UPR超純水機(jī)：四川優(yōu)普超純科技有限公司；KQ2200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酒醅游離阿魏酸含量測(cè)定

阿魏酸含量測(cè)定采用高效液相色譜法。

（1）高效液相色譜分析條件

參考文獻(xiàn)[28]測(cè)定酚酸類成分的液相色譜方法，并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。HPLC色譜條件如下：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為乙腈-0.09%磷酸（17∶83，V/V）；等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)316 nm。

（2）對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 5 g阿魏酸對(duì)照品，置于100 mL棕色量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶液，稀釋至刻度，配制質(zhì)量濃度為105 mg/L的阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。移液管準(zhǔn)確吸取對(duì)照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶液，稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為10.5 μg/mL游離阿魏酸對(duì)照品使用液。

（3）供試品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取干燥酒醅樣品1.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶液，振蕩混勻，超聲波法（超聲功率100W、超聲頻率40 kHz）50℃超聲20 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到供HPLC分析的樣品供試液。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋阿魏酸對(duì)照品使用液，分別配制成0.315 μg/mL、0.525 μg/mL、1.050 μg/mL、2.100 μg/mL、5.250 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)阿魏酸溶液，并在優(yōu)化色譜條件下分別測(cè)定3次，并取平均值。以阿魏酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程為：y=879.84x-10 548，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 8。

1.3.2 酒醅游離阿魏酸提取及其含量計(jì)算

取保存于-80 ℃冰箱的凍酒醅，冷凍干燥后，用粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，在設(shè)計(jì)的甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間以及提取溫度條件下，用超聲波法（超聲功率100 W、超聲頻率40 kHz）提取干酒醅中的游離阿魏酸。準(zhǔn)確稱取1.0 g干酒醅樣品，置于50 mL離心管中，加入甲醇溶液加以混勻，超聲提取后，在4 000 r/min條件下離心10 min，離心后吸取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，供HPLC分析。游離阿魏酸提取量計(jì)算公式如下：

式中：C為回歸方程計(jì)算出的游離阿魏酸含量，μg/mL；m為稱量干酒醅樣品質(zhì)量，g；V為甲醇溶劑體積，mL。

1.3.3 酒醅游離阿魏酸提取工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間以及提取溫度為自變量，以游離阿魏酸的提取量作為響應(yīng)值。各因素的水平梯度設(shè)置：甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%；料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）；提取時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；提取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burma試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）和提取溫度（D）共4個(gè)因素進(jìn)行了評(píng)估。以游離阿魏酸的提取量為響應(yīng)值，對(duì)每個(gè)因素取高水平和低水平值，篩選影響顯著的因子用于后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)，重復(fù)3次。Plackett-Burman試驗(yàn)的因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為自變量，以游離阿魏酸的提取量（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察各因素對(duì)游離阿魏酸提取量的影響程度，進(jìn)而得出提取酒醅中游離阿魏酸的最佳工藝條件。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 365和Origin 2019b進(jìn)行分析和處理。使用Minitab19.1對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，用Design-Expert 12.0.3對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅游離阿魏酸提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖1A可知，酒醅中游離阿魏酸提取量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%～60%時(shí)，阿魏酸提取量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增高；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，阿魏酸提取量最高，為（93.18±0.03）μg/g，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)＞60%之后，酒醅中游離阿魏酸的提取量反而降低，有可能是因?yàn)橛坞x阿魏酸量已經(jīng)達(dá)到了飽和，從而導(dǎo)致了酒醅中游離阿魏酸的提取量降低。因此，最適甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

由圖1B可知，酒醅中游離阿魏酸提取量隨料液比的增加先升高后降低，當(dāng)料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）時(shí)，阿魏酸提取量隨之增高，當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，阿魏酸提取量最高，為（90.67±0.60）μg/g，當(dāng)料液比在1∶30～1∶50（g∶mL）時(shí)，阿魏酸提取量隨之降低。這是因?yàn)榱弦罕忍r(shí)，提取液密度大，甲醇溶劑與酒醅不能充分接觸，料液比繼續(xù)增大，酒醅中游離阿魏酸提取量反而減小，有可能是因?yàn)殡S著料液比的增加，酒醅中的其他物質(zhì)成分也隨著提取出來(lái)，造成游離阿魏酸提取量降低。因此，最適料液比為1∶30（g∶mL）。

由圖1C可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅中游離阿魏酸提取量先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為5～10 min時(shí)，阿魏酸提取量隨之增高，在提取時(shí)間為10 min時(shí)，阿魏酸提取量最高，為（85.62±0.21）μg/g，當(dāng)提取時(shí)間＞10 min之后，阿魏酸提取量隨之下降。因?yàn)樘崛r(shí)間可能過(guò)長(zhǎng)，酒醅中的游離阿魏酸部分被氧化分解掉，從而導(dǎo)致提取量減少。因此，最適提取時(shí)間為10 min。

由圖1D可知，隨提取溫度的升高，酒醅中游離阿魏酸的提取量先增加后趨于平緩，當(dāng)提取溫度為30～60 ℃時(shí)，阿魏酸提取量隨之增高，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，阿魏酸提取量最高，為（80.86±0.50）μg/g，當(dāng)提取溫度＞60 ℃之后，阿魏酸提取量隨之下降。但是溫度不宜太高，如果溫度過(guò)高，阿魏酸的結(jié)構(gòu)可能因熱作用而改變，含量會(huì)降低。因此，最適提取溫度為60 ℃。

圖1 不同因素對(duì)游離阿魏酸提取效果的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction effect of free ferulic acid

2.2 酒醅游離阿魏酸提取工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，使用Minitab軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（C）對(duì)酒醅中游離阿魏酸的提取量有極顯著影響（P＜0.01），料液比（B）、提取溫度（D）對(duì)酒醅中游離阿魏酸提取量有顯著影響（P＜0.05）。因此，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間以及提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of Plackett-Burman experiments

2.3 酒醅游離阿魏酸提取工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為自變量，以游離阿魏酸提取量（Y）響應(yīng)值，優(yōu)化酒醅中游離阿魏酸的提取工藝，采用Box-Behnke試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。通過(guò)Design-Expert 12.0.3對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，得到二次多項(xiàng)式方程為：Y=91.75-1.18A+4.51B-2.04C+1.72D-1.79AB-0.791 4AC-0.9173AD-0.602 8BC-0.726 5BD-1.56CD-11.15A2-7.51B2-2.57C2-3.96D2

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

由表6可知，模型F值=27.22，P值＜0.01，表明該模型極顯著，并且模型的失擬項(xiàng)（P值=0.848 7＞0.05）不顯著，表明所選模型具有良好的擬合度，能較好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。決定系數(shù)R2為0.962 6，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.929 1，表示該模型能夠解釋92.91%的阿魏酸含量變化，進(jìn)一步表明回歸方程具有良好的擬合度。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由P值可知，在模型中，一次項(xiàng)B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)A對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，4個(gè)因素對(duì)游離阿魏酸提取量的影響大小依次為料液比（B）＞提取時(shí)間（C）＞提取溫度（D）＞甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）。

2.3.2 各因素交互作用對(duì)游離阿魏酸提取量影響的響應(yīng)面分析

采用Design-Expert12.0.3軟件繪制各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖2。通過(guò)響應(yīng)面及等高線可以直觀地分析各因素及因素之間的交互作用對(duì)游離阿魏酸提取量的影響[29]。響應(yīng)面圖中曲線越是彎曲，表明研究因素對(duì)結(jié)果的影響就愈大，橢圓形等高線表示研究因素之間的交互作用明顯，圓形等高線則表示交互作用不明顯。每條曲線上的提取質(zhì)量是相同的，圖形顏色從藍(lán)色到紅色表示提取質(zhì)量由少變多，顏色變化越快，坡度越大，即對(duì)結(jié)果的影響越顯著。

由圖2可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度中任意兩個(gè)變量取0水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)酒醅中游離阿魏酸提取量的影響。三維響應(yīng)面圖基本上是拋物形的，在曲面上有最高點(diǎn)，很容易出現(xiàn)最大值。從圖2可以看出，AB的響應(yīng)面曲線最陡，等高線相對(duì)較緊密，因此AB的交互作用對(duì)酒醅中游離阿魏酸的提取量影響相對(duì)顯著；CD的交互作用對(duì)酒醅中游離阿魏酸的提取量也有一定的影響；AC、AD、BC和BD的響應(yīng)曲面相對(duì)平坦，等高線松散，表明AC、AD、BC和BD的交互作用對(duì)酒醅中游離阿魏酸提取量的有較小的影響。交互作用對(duì)酒醅中游離阿魏酸提取量的影響順序?yàn)椋篈B＞CD＞AD＞AC＞BD＞BC。

圖2 各因素交互作用對(duì)游離阿魏酸提取效果影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the extraction effect of free ferulic acid

2.3.3 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)得到芝麻香型白酒酒醅中游離阿魏酸的提取最佳工藝為：甲醇體積分?jǐn)?shù)59.28%、料液比1∶33.152（g∶mL）、提取時(shí)間7.432 min以及提取溫度62.984 ℃。此時(shí)酒醅中游離阿魏酸提取量理論值為93.285 μg/g。考慮到試驗(yàn)的客觀條件以及操作簡(jiǎn)便性，因此改進(jìn)后的最佳條件為：甲醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取時(shí)間7.5 min、提取溫度63 ℃。在此最佳提取工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，酒醅中游離阿魏酸的提取量實(shí)際值為（91.50±2.99）μg/g，與預(yù)測(cè)值93.285 μg/g誤差值為1.91%，說(shuō)明試驗(yàn)所得數(shù)學(xué)模型可以較好的預(yù)測(cè)各因素和評(píng)價(jià)指標(biāo)之間關(guān)系，適用于該酒醅游離阿魏酸提取工藝優(yōu)化。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定酒醅中游離阿魏酸提取過(guò)程中的各個(gè)因素對(duì)游離阿魏酸提取量的影響力大小依次為甲醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。最佳提取工藝條件為：甲醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取時(shí)間7.5 min、提取溫度63 ℃。在此最佳提取工藝條件下，游離阿魏酸提取量實(shí)際值為（91.50±2.99）μg/g，較優(yōu)化前提高13%。實(shí)測(cè)值與理論值總體吻合，說(shuō)明模型可以較好的預(yù)測(cè)響應(yīng)值，優(yōu)化條件可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。