三相萃取法提取啤酒廢酵母β-葡聚糖及其抗氧化活性研究

張 軍，聶 卉，李寒露，金夢佳，魏雙羽，張 凱，張?jiān)茢?shù)，李乾偉

（鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044）

β-葡聚糖是具有重要生物活性的天然多糖，主要來源于酵母等[1]。據(jù)中國食品工業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布數(shù)據(jù)[2]，2020年我國啤酒廢酵母產(chǎn)量3.41～5.17萬t[3]，廢酵母主要作為飼料發(fā)展畜牧業(yè)[4]。近年來，隨著營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)酵母β-葡聚糖的功能如抗腫瘤[5]、益生元效用[6]、抑制和預(yù)防糖尿病[7]等越來越重視，因而，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）推薦每日攝入量3 g以上[8]，我國批準(zhǔn)酵母β-葡聚糖為新食品原料[9]。酵母β-葡聚糖水溶性較差，如何從酵母中高效提取成為制約β-葡聚糖進(jìn)一步應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。

酵母β-葡聚糖提取的方法主要有酶堿法、超聲波輔助酸或堿法、酸堿法等[10]，這些提取方法的共同特點(diǎn)是酸堿用量大，工藝過程復(fù)雜、提取時(shí)間較長和污染環(huán)境等缺陷[11]。三相萃取法是近年來發(fā)展起來的一種新型萃取分離技術(shù)，它是基于3個(gè)共存液相物化性質(zhì)和親疏水性的差別，不同目標(biāo)物在三相體系中的分配不同，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜溶液中多目標(biāo)的同時(shí)萃取分離和純化[12]。文沛瑤等[13]研究了三相萃取法純化枸杞多糖關(guān)鍵參數(shù)，YAN J K等[14]使用三相萃取法研究分離提純河蜆多糖的影響因素等。至今為止，三相萃取法己在天然產(chǎn)物、工業(yè)廢水、醫(yī)藥生產(chǎn)等許多復(fù)雜溶液的處理上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用的前景[15-17]，但在啤酒廢酵母β-葡聚糖分離提純的研究鮮見報(bào)道。基于三相萃取法高效、環(huán)保的特點(diǎn)，研究分離提純酵母β-葡聚糖的關(guān)鍵因素，為開發(fā)啤酒廢酵母資源化、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

本試驗(yàn)以啤酒生產(chǎn)廢酵母為原料，采用獨(dú)創(chuàng)的二級(jí)提取純化法：超聲耦合蛋白酶處理啤酒廢酵母（酸酶法）→三相萃取法分離提純?chǔ)?葡聚糖，探索酵母β-葡聚糖的分離提純規(guī)律，測定β-葡聚糖的抗氧化性，以期為降低酵母β-葡聚糖生產(chǎn)成本、拓展應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母泥：由化工食品學(xué)院精釀啤酒工廠提供；酒石酸、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、硫酸銨（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；木瓜蛋白酶（300 IU/g）、叔丁醇、1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（98%）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（diammonium 2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（≥98.0%）、過二硫酸鉀（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A1124分析天平、723PC型可見光分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；80～100目分樣篩：上虞市五四儀器篩具廠；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；IRTracer-100傅立葉變換紅外光譜儀、ZH-13型壓片機(jī)：島津（中國）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母β-葡聚糖提取液制備

啤酒酵母泥預(yù)處理：參照衣海龍等[18]的方法稍作修改。取適量酵母泥，3倍體積蒸餾水進(jìn)行清洗，攪拌均勻，用80目篩除去80%可見雜質(zhì)，用100目篩除去全部可見雜質(zhì)。過篩后的樣液2 000 r/min離心處理5 min。去沉淀加入5%的酒石酸溶液（酵母泥與酒石酸溶液體積比1∶5），靜置40～60 min。酒石酸處理后的樣液再次2 000 r/min離心5 min，將上清液倒出，得到預(yù)處理后的酵母懸液。

蛋白酶耦合超聲提取酵母β-葡聚糖：參照石豪磊等[19]方法稍作修改。首先將酵母泥加入2倍體積蒸餾水進(jìn)行稀釋，木瓜蛋白酶添加量為0.3%，在搖床中40 ℃酶解15 h，溶液pH值為5；酶解進(jìn)行到14.5 h時(shí)，將反應(yīng)體系放入超聲處理儀中，設(shè)置超聲頻率為40 kHz，30 ℃超聲處理30 min。將超聲處理后的懸液于3 500 r/min離心10 min，收取上清液，即得酵母β-葡聚糖粗提液。

1.3.2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

取10 mL酵母β-葡聚糖粗提液，加入（NH4）2SO4使其含量分別為10%、20%、30%、40%、50%，再分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL叔丁醇溶液，制配三相萃取體系。調(diào)節(jié)pH至5.5，磁力攪拌10 min使三相混合均勻后于5 000 r/min離心10 min加速三相的萃取劑分離。將離心后的三相體系分別放置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃條件下靜置萃取60 min，使其完全分離后，棄去上、中層，保留下層溶液，并測定多糖含量及萃取率。

1.3.3 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取叔丁醇添加量（A）、（NH4）2SO4含量（B）、萃取溫度（C）為3個(gè)自變量，以啤酒酵母β-葡聚糖萃取率（P）為響應(yīng)值，運(yùn)用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選擇Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。單因素變量分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction and purification of yeast β-glucan by three-phase extraction

1.3.4 酵母β-葡聚糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定樣品中的酵母β-葡聚糖含量[20]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=0.2966X-0.00187（R2=0.9992）。

酵母β-葡聚糖提取率按式計(jì)算：

式中：M1為粗多糖質(zhì)量，g；M2為啤酒廢酵母質(zhì)量，g。

1.3.5 酵母β-葡聚糖抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力：參照馬吉鋒等[4]的試驗(yàn)方法，稍作修改。

ABTS自由基清除能力：參照魏晨業(yè)等[21]的試驗(yàn)方法，稍作修改。

清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為不加樣品時(shí)的吸光度值；A為加入樣品后的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 叔丁醇添加量對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響

由圖1可知，隨著叔丁醇添加量的增加，啤酒酵母β-葡聚糖萃取率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)叔丁醇添加量為10 mL時(shí)，啤酒酵母β-葡聚糖萃取率達(dá)到最大值為85.3%。當(dāng)叔丁醇添加量繼續(xù)增加，萃取率反而減小，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于叔丁醇的含量過高不利于三相體系的穩(wěn)定或叔丁醇與（NH4）2SO4溶液發(fā)生作用[14]。因此，三相萃取液最適叔丁醇添加量為10 mL。

圖1 叔丁醇添加量對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.1 Effect of tert-butanol addition on extraction rate of β-glucan from yeast

2.1.2 （NH4）2SO4含量對(duì)酵母β-葡聚糖提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)（NH4）2SO4含量從10%增至20%時(shí)，啤酒β-葡聚糖提取率緩慢升高，當(dāng)（NH4）2SO4含量為20%時(shí)提取率最高，為84.3%。β-葡聚糖萃取率隨著（NH4）2SO4含量的增加逐漸升高，可能是因?yàn)镹H4+、SO42-可以穩(wěn)定溶液體系中的大分子相互作用，從而使得溶液體系更加穩(wěn)定。（NH4）2SO4含量超過20%以后，β-葡聚糖萃取率開始下降，可能是由于無機(jī)鹽濃度過高導(dǎo)致多糖與水分子之間的作用力減弱，萃取率隨之降低[22]。因此，根據(jù)β-葡聚糖萃取率變化，確定最適（NH4）2SO4含量為20%。

圖2 （NH4）2SO4含量對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.2 Effect on (NH4)2SO4 contents on extraction rate of β-glucan from yeast

2.1.3 萃取溫度對(duì)酵母β-葡聚糖提取率的影響

由圖3可知，萃取體系的溫度從20 ℃上升至40 ℃時(shí)，酵母β-葡聚糖萃取率從73.6%增大至85.1%。在萃取體系中，隨著溫度的升高，暴露出來的更多羥基的有利于氫鍵形成，使得三相體系更加穩(wěn)定，含多羥基的多糖親水性增強(qiáng)[23]，更多的β-葡聚糖從粗提掖中進(jìn)入到萃取溶液下層，進(jìn)而萃取率增加。當(dāng)萃取溫度高于40 ℃并持續(xù)升高時(shí)，萃取率開始下降。因此，根據(jù)β-葡聚糖萃取率變化，選擇萃取溫度40 ℃為最佳。

圖3 萃取溫度對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of β-glucan from yeast

2.2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及其分析

三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 三相萃取法萃取純化酵母β-葡聚糖條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction and purification of yeast β-glucan by three-phase extraction

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得叔丁醇添加量（A）、（NH4）2SO4含量（B）和萃取溫度（C）的多元二次回歸方程，確定以酵母β-葡聚糖萃取率（P）為目標(biāo)函數(shù)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由表3可知，二次多項(xiàng)式擬合模型極顯著（P＜0.000 1），表明此模型極為顯著，即各因素與響應(yīng)值之間相關(guān)性顯著。模型失擬項(xiàng)P=0.307 9＞0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著。顯著性結(jié)果分析表明，一次項(xiàng)A對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、B2、C2及交互項(xiàng)AB、BC對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響極顯著（P＜0.01）。各個(gè)因素對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率影響的大小順序依次為：（NH4）2SO4含量＞叔丁醇添加量＞萃取溫度。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests results

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)曲面圖，根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，探討叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量以及萃取溫度對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率的影響。分別將叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量以及萃取溫度的其中一個(gè)因素固定在0水平，得到另2個(gè)因素交互的影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及等高線見圖4。

從圖4根據(jù)曲面彎曲的程度可知，影響酵母β-葡聚糖萃取率最顯著的因素為（NH4）2SO4含量，極值靠近等高線圓心處，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化幅度較大，叔丁醇添加量也較為顯著，萃取溫度響應(yīng)面幅度變化平緩，說明其對(duì)結(jié)果影響較小。

圖4 叔丁醇添加量、（NH4）2SO4含量及萃取溫度交互作用對(duì)酵母β-葡聚糖萃取率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on effect on extraction rate of β-glucan from yeast

利用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳提取條件為叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，溫度為35.7 ℃，酵母β-葡聚糖萃取率理論值可達(dá)94.25%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性，選取條件叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，溫度為35.7 ℃，實(shí)際測得酵母β-葡聚糖得率90.13%，比回歸模型預(yù)測理論值低4.12%。該試驗(yàn)結(jié)果比張桂香等[24]研究得率高，主要原因是本試驗(yàn)采用的是在超聲耦合蛋白酶提取基礎(chǔ)之上的再次提純，響應(yīng)面法相當(dāng)于純化成品。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到提取酵母β-葡聚糖最佳條件的數(shù)據(jù)可靠，具有使用價(jià)值。

2.3 酵母β-葡聚糖抗氧化活性

由圖5可知，酵母β-葡聚糖對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增加而逐漸升高，當(dāng)酵母β-葡聚糖質(zhì)量濃度為8mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除率為60.5%、50.5%。相同質(zhì)量濃度條件下，酵母β-葡聚糖對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力均低于維生素C。多糖的自由基清除能力與單糖結(jié)構(gòu)、分子大小、類別和構(gòu)象有關(guān)[25]。酵母β-葡聚糖中的葡萄糖是還原劑，可以提供H+，H+可以與DPPH自由基結(jié)合，形成穩(wěn)定的DPPH-H終止自由基反應(yīng)[26]。

圖5 酵母β-葡聚糖對(duì)DPPH和ABTS的清除率Fig.5 Scavenging rate of DPPH and ABTS by β-glucan from yeast

表明酵母β-葡聚糖對(duì)于DPPH、ABTS自由基具有一定的清除作用，可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步研究，在多糖提取分離純化優(yōu)化的前提下，其抗氧化活性可能會(huì)有一定程度上的增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波耦合木瓜蛋白酶提取廢酵母中粗多糖，再使用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化三相萃取法萃取酵母β-葡聚糖提純工藝，利用軟件建立回歸模型預(yù)測提純的最佳提取工藝條件，結(jié)果表明，最佳提取條件為叔丁醇添加量為9.4 mL，（NH4）2SO4含量為27.4%，萃取溫度為35.7 ℃，在此條件下，酵母β-葡聚糖萃取率為90.13%。通過體外抗氧化試驗(yàn)表明，試驗(yàn)所得酵母β-葡聚糖對(duì)DPPH、ABTS自由基均有一定清除作用，且清除能力的強(qiáng)弱與酵母β-葡聚糖樣品濃度存在量效關(guān)系，當(dāng)酵母β-葡聚糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL，清除率分別為60.5%、50.5%，表現(xiàn)出較好體外抗氧化活性。

本研究的其創(chuàng)新之處在于使用超聲波耦合木瓜蛋白酶提取廢酵母中粗多糖，得到的粗多糖經(jīng)過三相萃取一步完成純化。結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化三相萃取的最佳提取條件，完成酵母β-葡聚糖純化，提取效率高，不使用大量的酸、堿，對(duì)環(huán)境友好。