利用根霉發(fā)酵發(fā)芽黑豆前后營養(yǎng)、活性和風(fēng)味成分的變化

何曉桐，吳姍姍，成鈺瑩，黃達(dá)榮，杜 冰*，黎 攀

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

豆豉是以黃豆、黑豆等為主要原料在微生物的共同作用下經(jīng)發(fā)酵制成的食品，與豆醬、醬油、腐乳并稱為中國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。豆豉除了含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分以外，還含有大豆異黃酮、豆豉多糖、γ-氨基丁酸、大豆低聚糖等多種天然活性成分[1]，因此具有預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、抗疲勞及減少衰老等功效。根據(jù)所用菌種的不同，豆豉可分為毛霉型、曲霉型、根霉型和細(xì)菌型豆豉。

有研究表明，從南方小酒藥中篩選出來的中國根霉（Rhizopus chinesis）12號(hào)，產(chǎn)孢子能力強(qiáng)，孢子數(shù)多，生長速度快，且孢囊孢子較小，具有能產(chǎn)高活性溶栓酶的特點(diǎn)[2]。溫嘉敏等[3]以中國根霉12號(hào)為發(fā)酵菌株，優(yōu)化具有高活力溶栓酶的淡豆豉發(fā)酵工藝，在最優(yōu)工藝下得到的淡豆豉溶栓酶活力為（17 122±392.7）U/g。黑豆在萌發(fā)過程中，蛋白質(zhì)含量顯著增加[4]，同時(shí)，一些營養(yǎng)物質(zhì)的分解可形成γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）和黃酮類等功能性物質(zhì)。遲莉[5]研究表明，黑豆芽干基中總黃酮含量較干種子約增加20 mg/g。使用中國根霉12號(hào)發(fā)酵黑豆能顯著增加豆豉的溶栓酶活性[6]，蔡尤林[2]以溶栓酶活性作為指標(biāo)，通過對比不同種類豆子制作成的淡豆豉，發(fā)現(xiàn)黑豆相比紅豆、黃豆等更適合作為淡豆豉的發(fā)酵原料，且經(jīng)過發(fā)芽處理后，其溶栓酶活性顯著增加。國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵豆制品的研究多集中于曲霉型和細(xì)菌型發(fā)酵[7]。

本研究以河南、云南、黑龍江、內(nèi)蒙古和福建5個(gè)不同產(chǎn)地的黑豆為研究對象，利用中國根霉12號(hào)發(fā)酵發(fā)芽黑豆，通過對發(fā)酵前后營養(yǎng)成分與活性成分含量測定、頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術(shù)以及電子鼻技術(shù)，探究不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆發(fā)酵后風(fēng)味的變化，并對不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)電子鼻分析結(jié)果進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（clustering analysis，CA）。目前對于我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品品質(zhì)發(fā)酵規(guī)律的研究較少，本課題組已有研究利用中國根霉12號(hào)發(fā)酵生產(chǎn)得到具有高溶栓活性的淡豆豉。為了進(jìn)一步提高其風(fēng)味品質(zhì)，滿足市場需求，本研究探究了不同產(chǎn)地黑豆作為豆豉生產(chǎn)原料對其營養(yǎng)和風(fēng)味品質(zhì)形成影響的差異，旨在通過品質(zhì)和風(fēng)味分析比較，研制出一種風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值都能有所提升的根霉型豆豉，為今后的根霉型豆豉的發(fā)酵工藝及風(fēng)味分析提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

河南黑豆：開封市弘津食品有限公司；福建黑豆：福建省遠(yuǎn)山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司；云南黑豆：云南東巴客食品有限公司；黑龍江黑豆：十月稻田農(nóng)業(yè)科技有限公司；中國根霉（Rhizopus chinesis）12#：保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料評價(jià)及研究中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

纖維蛋白原（分析純）、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：中國藥品生物制品檢定所；大豆素、黃豆黃素、染料木素、大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.5%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津市東方化工廠；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）、次氯酸鈉溶液、磺基水楊酸、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：廣州成碩生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

中國根霉12號(hào)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。121 ℃滅菌15 min。

PDA液體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基不加瓊脂。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；GC-MSQP2010 ULTRA氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：島津株式會(huì)社；Rapid N exceed杜馬斯定氮儀：上海艾力蒙塔貿(mào)易有限公司；BPH-9042恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PEN3電子鼻：北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；752-N型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Scan Speed 40真空冷凍干燥機(jī)：丹麥Labo Gene公司；JCSZ-300水浴恒溫振蕩器：青島智匯谷信息技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中國根霉12號(hào)種子液的制備

取中國根霉12號(hào)保藏菌種1～2環(huán)，接入斜面PDA培養(yǎng)基中，32 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d后，接種培養(yǎng)好的斜面菌種2環(huán)到擴(kuò)大液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中32 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 d，得到菌株種子液，備用。

1.3.2 根霉發(fā)酵發(fā)芽黑豆的制備

將不同產(chǎn)地的黑豆用水沖洗干凈后，加入2～5倍質(zhì)量的清水，避光浸泡12 h后取出黑豆瀝干，平鋪于泡沫箱中，蓋上濕潤的紗布，20 ℃避光放置于恒溫培養(yǎng)箱，每隔12 h后再次浸潤紗布48 h后可得發(fā)芽黑豆，挑選新鮮無腐爛，芽長約3～8 mm的發(fā)芽黑豆，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至35 ℃以下，接種中國根霉12號(hào)種子液至滅菌冷卻后的發(fā)芽黑豆中（接種量為15%），在32 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，得到根霉型發(fā)酵發(fā)芽黑豆[2]。

1.3.3 發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后營養(yǎng)成分及活性成分

取發(fā)酵前、后發(fā)芽黑豆置于-18 ℃超低溫冰箱內(nèi)預(yù)凍12 h，取出放在冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥，冷阱溫度為80 ℃左右，時(shí)間為24 h，凍干后粉碎，過80目篩，得到發(fā)酵前、后發(fā)芽黑豆粉末樣品，進(jìn)行營養(yǎng)成分及活性成分的測定。

溶栓酶活性測定：溶栓酶活性可通過纖維蛋白平板法測定，參照李俊健等[6]的方法，以尿激酶的活力單位表示溶栓酶活性。氨基酸態(tài)氮的測定：參照國標(biāo)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；總酸測定：參照國標(biāo)GB12456—2021《食品中總酸的測定》；灰分測定：參考GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；脂肪測定：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；蛋白質(zhì)測定：采用杜馬斯燃燒法；還原糖、總糖測定：參考高文軍等[8]的方法；γ-氨基丁酸測定：參考萬藍(lán)婷等[9]的方法；大豆異黃酮測定：參考于寒松等[10]的方法。

1.3.4 發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后風(fēng)味成分測定

發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后風(fēng)味成分的測定采用HS-SPME/GC-MS法。

HS-SPME方法萃取樣品揮發(fā)性成分：取樣品2g于50mL頂空瓶，加10 μL稀釋200倍的環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)，密封，90 ℃平衡5 min，插入已經(jīng)活化好的DVB/CAR/PDMS萃取頭，頂空吸附30 min，插入GC進(jìn)樣口解吸3 min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60m×0.25mm，0.25μm），載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，設(shè)置升溫程序條件為：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，色譜柱初始溫度為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 的速度上升至220 ℃，保持5 min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，發(fā)射電流80 μA，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，掃描范圍為30～400 m/z。

定性定量分析：將各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）及WILEY兩個(gè)譜庫，對質(zhì)譜圖進(jìn)行串連檢索，與有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行核對，并結(jié)合人工解析，綜合保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)對組分進(jìn)行定性。采用內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)被測化合物和內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮相應(yīng)的色譜峰面積之比，計(jì)算被測組分的含量，其計(jì)算公式如下：

式中：Mc為化合物含量，μg/kg；ST為總離子流圖中化合物峰面積；C標(biāo)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/mL；S標(biāo)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積；V標(biāo)為內(nèi)標(biāo)物加入的體積，μL；m為樣品質(zhì)量，kg。

1.3.5 電子鼻測定氣味強(qiáng)度

分別稱取不同發(fā)酵階段不同品種發(fā)芽黑豆發(fā)酵后曲料樣品3.0 g，裝入密封塑料杯中，室溫平衡30 min后，插入電子鼻的進(jìn)樣針頭進(jìn)行氣味強(qiáng)度測定。

測定條件：采樣時(shí)間1 s/組；傳感器自清洗時(shí)間120 s；傳感器歸零時(shí)間10 s；樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s；進(jìn)樣流量400 mL/min；分析采樣時(shí)間120 s。采用電子鼻內(nèi)置程序（Winmuster，version 1.6.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 26.0和GraphPad Prims 8等統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖，采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后營養(yǎng)成分變化

不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量的變化見表1。由表1可知，對比不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆，發(fā)酵處理使得總糖含量下降，蛋白質(zhì)和GABA含量上升，五個(gè)產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵后的總糖含量均顯著下降（P＜0.05），尤以黑龍江和河南發(fā)芽黑豆發(fā)酵后的總糖含量下降最為顯著，相比發(fā)酵前分別降低了37.60%和38.95%。還原糖是豆豉中甜味的來源之一，在發(fā)酵過程中主要是由微生物分解總糖轉(zhuǎn)化而來的[11]，五個(gè)產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵后還原糖含量均有不同程度的上升，其中內(nèi)蒙古、黑龍江和云南發(fā)芽黑豆發(fā)酵后的還原糖含量為（27～28）mg/g，顯著高于其他產(chǎn)地（P＜0.05）。由于在發(fā)酵過程中，霉菌等微生物分泌大量的淀粉酶等，將黑豆中的淀粉大量水解，同時(shí)也有糖化酶等酶系存在，即使微生物生長需要消耗還原糖，但是還原糖的生成量在多種酶系作用下仍略高于消耗量，所以最終得到的發(fā)酵后發(fā)芽黑豆還原糖含量高于發(fā)酵前發(fā)芽黑豆。

表1 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量的變化Table 1 Changes of nutrient ingredient contents of germinated black bean from different origins before and after fermentation

黑豆發(fā)酵伴隨著蛋白質(zhì)降解成多肽和氨基酸的過程，不同產(chǎn)地的黑豆在經(jīng)過發(fā)芽及發(fā)酵處理后，其蛋白質(zhì)含量均有所升高，這可能是因?yàn)橹袊?2號(hào)分泌的微生物酶將非蛋白含氮物質(zhì)降解為氨后，在酶催化的作用下進(jìn)一步同化為氨基酸，最終生成菌體蛋白[12]。

GABA是在人腦能量代謝過程中起重要作用的活性氨基酸，具有精神安定、改善腦機(jī)能、促進(jìn)生長激素分泌等多種生理功能，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的GABA是安全環(huán)保的[13]。有研究發(fā)現(xiàn)大豆經(jīng)萌發(fā)24 h后，豆芽中的GABA的含量從26.5 mg/100 g增加到718 mg/100 g[14]，熊京京等[15-16]認(rèn)為，GABA作為淡豆豉中的有效成分，可通過控制微生物發(fā)酵過程富集得到，從而提高其藥用營養(yǎng)價(jià)值。由表1可知，在黑豆發(fā)芽的基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵，不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆發(fā)酵處理后GABA含量均顯著增加（P＜0.05），云南產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵處理后GABA含量可高達(dá)（6.68±0.07）mg/g，故而從營養(yǎng)成分的含量變化分析，云南產(chǎn)地的黑豆更適宜用于淡豆豉的生產(chǎn)制作。根霉型發(fā)芽發(fā)酵黑豆能產(chǎn)生GABA可能是由于中國根霉12號(hào)含有編碼谷氨酸脫羧酶的基因，分泌的高活性谷氨酸脫羧酶使得谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸以達(dá)到富集的目的[17]。

2.2 不同產(chǎn)地黑豆及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后活性成分含量的變化

2.2.1 不同產(chǎn)地黑豆及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后大豆異黃酮含量變化

大豆異黃酮是一種植物雌激素，分為苷元形式和葡萄糖苷形式，具有抗腫瘤、抗溶血等功效[18]。不同產(chǎn)地黑豆以及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后的大豆異黃酮總含量變化見圖1。由圖1可知，不同產(chǎn)地的黑豆經(jīng)過發(fā)芽處理，其總大豆異黃酮含量均顯著增加（P＜0.05），其中黑龍江發(fā)芽黑豆對比原料上升最多，平均上升了1.71 mg/g，這與GUAJARDO-FLORES D等[19]研究黑豆萌發(fā)處理可使其黃酮醇含量顯著增加的結(jié)果相符合。早有研究證明了發(fā)芽處理能使大豆異黃酮含量增加是因?yàn)殡S著呼吸作用的增強(qiáng)，苯丙氨酸氨基裂解酶作為異黃酮生物合成代謝的關(guān)鍵酶，其數(shù)量大幅增加[20]。所選取的五個(gè)產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆中，大豆異黃酮含量最高的為云南發(fā)芽發(fā)酵黑豆，達(dá)到（4.57±0.04）mg/g，其余產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆中大豆異黃酮總含量差異較小，因而從大豆異黃酮總含量方面比較，云南產(chǎn)地的黑豆質(zhì)量較優(yōu)。

圖1 不同產(chǎn)地黑豆以及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后的大豆異黃酮總含量變化Fig.1 Changes of total contents of soybean isoflavone of black beans and germinated black beans from different origins before and after fermentation

發(fā)芽過程中苯丙烷類代謝[21]和丙二酸代謝[22]途徑中的三羧酸循環(huán)及輔酶A循環(huán)與糖苷型的大豆異黃酮向苷元型的大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。黑豆在萌發(fā)的過程中其β-葡糖酶（β-glucosidase）被激活，將異黃酮葡糖苷上的葡糖苷去除形成苷元[23]。王慧芳等[24]研究發(fā)現(xiàn)，30 ℃條件下發(fā)芽有利于中黃豆中異黃酮含量的累積，且發(fā)芽期間糖苷型異黃酮含量先上升后下降，苷元型則主要表現(xiàn)為增加。不同產(chǎn)地黑豆以及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后的大豆異黃酮單體含量變化見表2。

表2 不同產(chǎn)地黑豆以及發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后的大豆異黃酮單體含量變化Table 2 Changes of monomer contents of soybean isoflavone in black beans and germinated black beans from different origins before and after fermentation μg/g

續(xù)表

由表2可知，不同產(chǎn)地黑豆發(fā)酵前糖苷型異黃酮所占比例為83.19%～94.49%，說明大豆異黃酮主要是以糖苷型存在，而發(fā)酵后糖苷型異黃酮所占比例則降為51.57%～63.25%，其中云南發(fā)芽發(fā)酵黑豆的苷元含量約是原黑豆的7倍，黑龍江發(fā)芽發(fā)酵黑豆的苷元含量約為原黑豆的8倍。發(fā)酵處理有利于發(fā)芽黑豆的糖苷型異黃酮向苷元型異黃酮的轉(zhuǎn)變，由于苷元型異黃酮更容易被人體吸收，抗氧化能力也優(yōu)于糖苷型異黃酮[20]，因此，對比五個(gè)產(chǎn)地的黑豆發(fā)芽發(fā)酵處理后的異黃酮單體含量，云南產(chǎn)地黑豆的平均含量最高，更適宜作為發(fā)酵原料獲得較多的苷元型異黃酮，可有效提高發(fā)芽黑豆的營養(yǎng)功效。

2.2.2 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后氨基酸態(tài)氮和總酸含量

不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后氨基酸態(tài)氮和總酸含量測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后氨基酸態(tài)氮（A）及總酸（B）含量變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen (A) and total acid (B) contents in germinated black bean from different origins before and after fermentation

由圖2a可知，不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量都有了顯著性增加（P＜0.05），不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前氨基酸態(tài)氮含量為0.27～0.36 g/100 g，發(fā)酵后提升到0.77～0.91 g/100 g。云南和福建發(fā)芽黑豆發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量最高，分別為（0.91±0.05）g/100g和（0.91±0.02）g/100g，而河南發(fā)芽黑豆發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量最低，為（0.77±0.01）g/100 g。由圖2b可知，不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵后總酸含量都顯著性增加（P＜0.05），發(fā)酵前總酸含量為（0.59～0.76）g/100 g，發(fā)酵后提升到（1.42～1.93）g/100 g。其中，福建發(fā)芽黑豆的總酸含量最高，為1.93 g/100 g，而內(nèi)蒙古發(fā)芽黑豆的總酸含量最低，為1.42 g/100 g。

發(fā)芽黑豆的發(fā)酵過程涉及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在酶的催化下產(chǎn)生氨基酸態(tài)氮等小分子物質(zhì)，氨基酸態(tài)氮含量與發(fā)芽黑豆的風(fēng)味和營養(yǎng)有關(guān)，也是發(fā)芽黑豆發(fā)酵成熟的重要標(biāo)志，從5個(gè)產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵后的氨基酸態(tài)氮含量來看，云南和福建產(chǎn)地的黑豆質(zhì)量較優(yōu)。總酸含量影響發(fā)酵過程中發(fā)芽黑豆微生物生長與發(fā)酵，也影響發(fā)芽黑豆發(fā)酵成品的滋味形成[25]，由于發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸等酸類，發(fā)酵結(jié)束后豆豉的酸度顯著性增加。

2.2.3 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后溶栓酶活性變化

近年來，在豆制品中，溶栓酶逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，李俊健等[6]利用中國根霉12號(hào)對黑豆進(jìn)行混菌發(fā)酵，制作的淡豆豉溶栓酶活力可達(dá)（15 530.98±1 832.4）IU/g。不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后溶栓酶活性變化見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后溶栓酶活性的變化Fig.3 Changes of thrombolytic enzyme activities of germinated black bean from different origins before and after fermentation

由圖3可知，不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆發(fā)酵后相比發(fā)酵前，其溶栓酶活性均大幅增加，其中黑龍江產(chǎn)地發(fā)芽發(fā)酵黑豆的溶栓酶活性為（1 032.94±88.08）IU/g，顯著高于其他產(chǎn)地的溶栓酶活性（P＜0.05），其他產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆溶栓酶活性僅約為700 IU/g。各大豆品系按照溶栓酶活性由大到小排列依次為黑龍江＞云南＞福建＞內(nèi)蒙古和河南，因而從溶栓酶活性來看，黑龍江產(chǎn)地的黑豆質(zhì)量較優(yōu)。

2.3 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后風(fēng)味品質(zhì)變化

2.3.1 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性成分變化

不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性成分變化見表3。由表3可知，發(fā)芽黑豆在發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分種類都是以烷類、醇類和醛類為主，但其揮發(fā)性成分的含量有差異。發(fā)酵前云南、福建、河南、內(nèi)蒙古、黑龍江產(chǎn)地發(fā)芽黑豆分別共檢出揮發(fā)性物質(zhì)19種、21種、20種、18種和15種，發(fā)酵后分別共檢出為20種、14種、15種、18種和17種，賦予豆豉甜香、脂肪香、水果香和焦香的揮發(fā)性成分的含量在發(fā)酵后得到顯著提升，如2,3,5-三甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、壬醛、3-羥基-2-丁酮、2,3-二氫苯并呋喃等，黑龍江發(fā)芽黑豆發(fā)酵的揮發(fā)性物質(zhì)種類較發(fā)酵前增加了2種，增加的種數(shù)最多。

表3 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分含量GC-MS分析結(jié)果Table 3 Results of volatile flavor components contents of germinated black bean from different origins before and after fermentation analyzed by GC-MS μg/kg

續(xù)表

2,3,5-三甲基吡嗪在卷煙加香中應(yīng)用廣泛，具有濃郁的烘焙香、堅(jiān)果香。在發(fā)酵前，僅有云南發(fā)芽黑豆中檢測出這種物質(zhì)，但發(fā)酵結(jié)束后在黑龍江和云南產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆中均檢測到較高含量的2,3,5-三甲基吡嗪，而在黑龍江產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆中2,3,5-三甲基吡嗪含量更是上升到（20.36±0.17）μg/kg。醇類往往具有植物香和泥土芳香，雖然醇類的氣味閾值較高，但是作為合成前體的關(guān)鍵物質(zhì)，醇類可與有機(jī)酸形成酯類，有利于豆制品獨(dú)特風(fēng)味的形成。1-辛烯-3-醇為脂肪族不飽和醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣，屬天然等同香料[26]，其含量在黑豆發(fā)酵前后均較高，是豆制品主要揮發(fā)性成分之一，尤以黑龍江發(fā)芽發(fā)酵黑豆的1-辛烯-3-醇含量最高，為（15.36±0.60）μg/kg。壬醛是油酸的氧化裂解產(chǎn)物，具有花香、脂肪香、蠟香和甜桔香氣[27]，醛類與發(fā)芽發(fā)酵黑豆色澤深淺有一定關(guān)系，且醛類含量較高會(huì)帶來一種焦糖味[28]，有利于發(fā)芽發(fā)酵黑豆香味的形成。不同產(chǎn)地黑豆發(fā)酵后壬醛含量均有上升，黑龍江發(fā)芽發(fā)酵黑豆的壬醛含量最高，為（3.87±0.17）mg/g。3-羥基-2-丁酮具有甜香、奶制品香，并帶有脂肪的風(fēng)味，內(nèi)蒙古和黑龍江產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆中分別含有（1.49±0.05）μg/kg和（2.27±0.05）μg/kg的3-羥基-2-丁酮。在發(fā)芽發(fā)酵黑豆中檢測到的呋喃類成分主要是2,3-二氫苯并呋喃，有文獻(xiàn)報(bào)道過其主要由油脂氧化和碳水化合物降解產(chǎn)生，呈現(xiàn)出燒焦的甜味[29]。綜合比較得出，發(fā)芽發(fā)酵黑豆風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)為2,3,5-三甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、壬醛等，發(fā)現(xiàn)黑龍江產(chǎn)地的黑豆質(zhì)量較優(yōu)。

2.3.2 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后電子鼻分析

不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分電子鼻分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，這10種發(fā)酵前后的發(fā)芽黑豆樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分響應(yīng)值主要集中在傳感器7號(hào)、6號(hào)、9號(hào)（響應(yīng)值＞2），其中7號(hào)傳感器響應(yīng)值最高，表明硫化物、甲基類化合物、芳香化合物和有機(jī)硫化物對黑豆/豆豉整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率較大。而4號(hào)、5號(hào)、1號(hào)、10號(hào)傳感器的響應(yīng)值在1附近，表明其相關(guān)揮發(fā)物類型含量都比較低。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的樣品比發(fā)酵前的整體風(fēng)味更濃郁，其中以黑龍江發(fā)芽發(fā)酵樣品響應(yīng)值最大。

圖4 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分電子鼻分析雷達(dá)圖Fig.4 Radar diagram of volatile flavor components of germinated black bean from different origins before and after fermentation analysis by electronic nose

不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分電子鼻分析結(jié)果的主成分分析和聚類分析見圖5。

由圖5可知，從樣品特征聚類分析判斷，每種發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后樣本數(shù)據(jù)離散程度比較低，樣品檢測重現(xiàn)性比較好。從樣品與樣品之間的距離判斷，全部樣品可以分為3類，福建發(fā)芽黑豆發(fā)酵后樣品單獨(dú)為一類，且位于其他兩類之間，說明福建發(fā)芽黑豆發(fā)酵后樣品與其余幾類樣品的風(fēng)味有差異和共性；發(fā)酵前不同產(chǎn)地和內(nèi)蒙古發(fā)芽黑豆發(fā)酵后樣品為一類，其重疊部分較多，表明不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前的樣品和發(fā)酵后內(nèi)蒙古發(fā)芽黑豆樣品具有較多共性物質(zhì)；云南、河南和黑龍江發(fā)芽黑豆發(fā)酵后樣品為一類，表明雖然產(chǎn)地不同，但是發(fā)酵后生成的風(fēng)味成分呈現(xiàn)一定的相似性，通過PCA和CA可以顯著區(qū)分不同產(chǎn)地和發(fā)酵與否對風(fēng)味差異的影響，特別是發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后風(fēng)味差異明顯。

圖5 不同產(chǎn)地發(fā)芽黑豆發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味成分電子鼻分析結(jié)果的主成分分析和聚類分析Fig.5 Principal component analysis and clustering analysis of volatile flavor components of germinated black bean from different origins before and after fermentation analysis by electronic nose

3 結(jié)論

本研究采用中國根霉12號(hào)發(fā)酵不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆，能在一定程度上提升發(fā)芽黑豆的營養(yǎng)與活性成分含量。從營養(yǎng)成分上看，5個(gè)產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆通過發(fā)酵處理后，總糖含量均有所下降，蛋白質(zhì)和GABA含量都有不同程度的上升，其中云南產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆的GABA含量最高，其平均含量為（6.68±0.07）mg/g。不同產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆經(jīng)過發(fā)酵，大豆異黃酮總含量、氨基酸態(tài)氮以及總酸含量呈現(xiàn)出了不同程度的上升，尤以云南產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆活性成分最優(yōu)，其大豆異黃酮總含量和氨基酸態(tài)氮含量分別為（4.57±0.04）mg/g、（0.91±0.05）g/100 g。因此，云南產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆在營養(yǎng)及活性成分上優(yōu)于其他產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆。此外，黑龍江產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆溶栓酶活性為（1 032.94±88.08）IU/g，顯著高于其他4個(gè)產(chǎn)地（P＜0.05），最適宜作為生產(chǎn)具有高溶栓酶活性的發(fā)芽發(fā)酵黑豆制品。在風(fēng)味品質(zhì)變化上，黑龍江產(chǎn)地的發(fā)芽黑豆經(jīng)過發(fā)酵后，其2,3,5-三甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、壬醛、3-羥基-2-丁酮等成分含量呈不同程度上升，且含量均高于其他4個(gè)產(chǎn)地的發(fā)芽發(fā)酵黑豆，這些成分賦予了發(fā)芽發(fā)酵黑豆甜香、脂肪香、水果香和焦香等風(fēng)味，因此，在風(fēng)味方面上尤以黑龍江發(fā)芽黑豆發(fā)酵后品質(zhì)最佳。