降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其在菜用枸杞漿水發(fā)酵中的應用

趙海霞，吳 丹，王曉蕾，王藝璋

（1.銀川能源學院 化學與生物工程學院，寧夏 銀川 750100；2.北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏回族自治區(qū)農村能源工作站，寧夏 銀川 750001）

菜用枸杞是茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lyciun）植物枸杞（Lycium barbarumL.）的嫩莖葉，俗稱天精草、地仙苗，是富含黃酮、生物堿、萜類化合物和維生素等多種營養(yǎng)成分[1]的健康蔬菜。在西北，菜用枸杞作為蔬菜的食用方式，主要是焯水后涼拌。由于烹飪方式較單一，大量菜用枸杞無法短期內食用而造成浪費。

漿水是分布在我國西北地區(qū)的一種傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品，一般是將新鮮的蔬菜焯水后加入面湯，再加入老漿水作為“引子”，經多種微生物協(xié)同發(fā)酵而成[2]。因其制作工藝簡單，風味獨特，營養(yǎng)豐富，深受西北人民青睞[3]。漿水多為家庭自制，品質參差不齊，在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的存在限制了漿水的發(fā)展，對漿水中亞硝酸鹽的研究主要集中在變化規(guī)律和工藝發(fā)酵條件控制方面[4-5]。有關漿水中微生物組成的研究發(fā)現，乳酸菌作為漿水發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群之一，以乳酸菌為接入菌種，不僅具有降解亞硝酸鹽的作用，同時能形成漿水的獨特風味[6]。近年來，從柳州酸筍[7]、泡菜[8-9]、剁辣椒[10]等發(fā)酵蔬菜和發(fā)酵乳品[11]中篩選出能降解亞硝酸鹽的乳酸菌，但對漿水中可降解亞硝酸鹽乳酸菌的研究并不多見。

從適合漿水發(fā)酵的優(yōu)勢菌中篩選出高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌作為漿水發(fā)酵菌種，將菜用枸杞這種地源性蔬菜根據當地飲食習慣發(fā)酵制成漿水，既能豐富漿水專用功能性發(fā)酵菌種資源，還可以利用大量菜用枸杞資源開發(fā)新的安全健康的漿水產品。因此，本研究通過鹽酸萘乙二銨法從源自甘肅天水、定西和通渭等地農家自制漿水中，篩選出高效降解亞硝酸鹽的菌株，然后以菜用枸杞為原料進行漿水發(fā)酵。通過評價菜用枸杞漿水的風味、口感、色澤，測定亞硝酸鹽含量、pH值、總酸，以及分析菜用枸杞發(fā)酵前后多糖、甜菜堿和總黃酮含量的變化，以期能夠獲得既能高效降解亞硝酸鹽，又能適用菜用枸杞漿水發(fā)酵的專用乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

漿水：從甘肅天水、定西、通渭等地采集農家自制的漿水樣品9份，無菌離心管采樣，低溫帶回實驗室。菜用枸杞：采自寧夏銀川市西夏區(qū)地質局農場寧杞1號。商品漿水引子：購自新百超市漢中略陽寧強漿水引子（寧強引子）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[11]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，硫酸鎂0.1 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸錳0.05 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水定容至1 L，調節(jié)pH值6.2～6.4。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂1.5%。

MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中添加碳酸鈣1%。

1.1.3 試劑

對氨基苯磺酸、乙酸鋅、牛肉浸粉、葡萄糖、吐溫80、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、鹽酸、硼砂（均為分析純）：山東英朗化工有限公司；蛋白胨、酵母粉（均為分析純）：北京奧博星生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、檸檬酸二銨、氫氧化鈉、MgSO4·7H2O、乙酸鈉、K2HPO4·3H2O、亞鐵氰化鉀、MnSO4·H2O（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、TaqMaster Mix：北京康為世紀生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2J型雙人型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；UV1000紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科技公司；LDZX-50KBS型壓力蒸汽滅菌器：山東博科生物產業(yè)有限公司；SD303-4A型數顯電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；FA2204B電子天平：寧波三豐計量儀器有限公司；XGQ-200型電熱鼓風干燥箱：上海瀘越儀器責任有限公司；HH-2水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 漿水中乳酸菌的分離純化

取漿水樣品1 mL，采用生理鹽水按10倍系列梯度稀釋至10-7。分別吸取稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液100 μL注入培養(yǎng)皿，然后倒入15～20 mL 50 ℃左右的MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固后于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。根據菌落大小、形狀、顏色及鈣溶圈大小挑取單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上反復劃線純化2～3次、鏡檢，得到純菌落。對所有分離純化的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，若革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶接觸試驗呈陰性，可初步確定為乳酸菌。將純化后的疑似乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代2次后，甘油管保藏凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 乳酸菌菌株的分子生物學鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取疑似乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，參考劉建利等[12]方法PCR擴增16S rDNA基因序列，委托南京金斯瑞生物公司進行測序。將測序序列提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，從而對菌株進行菌種鑒定。

1.3.3 乳酸菌菌株降解亞硝酸鹽能力的測定

將-80 ℃保存的乳酸菌菌種室溫融化后，接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次。以2%（V/V）的接種量，將活化后的菌液接種于25 mL含125 μg/mL亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中，對照組接種2%無菌水，37 ℃培養(yǎng)72 h，每個試驗重復3次，測定培養(yǎng)液中亞硝酸鈉的含量，并計算各菌株的亞硝酸鹽降解率，其計算公式如下：

1.3.4 菜用枸杞漿水的發(fā)酵[13]

新鮮菜用枸杞→洗凈→切段→熱燙→加面湯→入壇→接種→漿水發(fā)酵

操作要點：稱量150 g新鮮菜用枸杞，將其沖洗干凈后切成4～5 cm的小段，用沸水熱燙3 min，22.5 g面粉中加入727.5 mL飲用水，混勻后煮沸制成面湯，將熱燙后的菜用枸杞與面湯按質量比1∶1混勻，裝入壇子中。按5%的接種量分別接入具有高效亞硝酸鹽降解能力的乳酸菌，同時設置對照（接入5%的無菌蒸餾水和接入5%寧強引子），30 ℃下恒溫發(fā)酵5 d。發(fā)酵結束后，測定漿水中的亞硝酸鹽含量、酸度及pH值。

1.3.5 菜用枸杞漿水的感官評價

參考侯智勇等[14]方法，隨機選10名無不良嗜好同學依據感官評價標準，從色澤、風味及口感方面對菜用枸杞漿水進行感官評定，滿分100分，具體評價標準見表1。

表1 菜用枸杞漿水感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of Lycium barbarum Jiangshui

1.3.6 菜用枸杞漿水理化指標的測定

采用GB/T 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二銨法測定亞硝酸鹽含量。按照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》測定總酸含量，以乳酸計。新鮮菜用枸杞與發(fā)酵后的枸杞菜65 ℃烘干至恒質量，粉碎后，40目過篩；采用苯酚-硫酸法[15]測定多糖含量，采用薄層掃描法[16]測定甜菜堿含量，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[17]測定總黃酮含量。

1.3.7 數據處理與分析

實驗重復3次，采用ExceL2010整理數據，采用SPSS22.0進行方差分析，采用Origin8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及鑒定

從不同地區(qū)來源的9份漿水樣品中共分離純化出35株乳酸菌，菌落特征均呈白色或乳白色，表面光滑，圓形隆起，邊緣整齊，菌落直徑在1～3 mm。細胞形態(tài)及部分生理生化實驗結果見表2。

由表2可知，35株菌株革蘭氏染色結果均呈陽性（G+），細胞呈桿狀或長桿狀，無芽孢，過氧化氫酶試驗結果均呈陰性，初步鑒定這35株菌為乳酸菌。進一步采用分子生物學技術對35株菌株進行鑒定，提取其基因組DNA，對其16S rDNA基因序列進行PCR擴增，測序后，測序結果在NCBI中進行BLAST同源性序列比對，結果見表3。

表2 不同來源乳酸菌細胞形態(tài)及生理生化特征Table 2 Cell morphology and physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria from different sources

表3 35株乳酸菌菌株16S rDNA基因序列的比對及鑒定結果Table 3 Comparison and identification results of 16S rDNA sequences of 35 strains of lactic acid bacteria

續(xù)表

續(xù)表

由表3可知，35株乳酸菌被鑒定為3個不同的屬，其中29株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），占82.86%，由此看出，9份漿水樣品中分離出的乳酸菌中植物乳桿菌占比最高，為優(yōu)勢菌。此外，3株乳酸菌被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），3株乳酸菌被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

2.2.1 亞硝酸鹽降解率及pH值的測定

35株乳酸菌菌株的亞硝酸鹽降解能力及發(fā)酵液的pH值見表4。

由表4可知，35株乳酸菌均具有亞硝酸鹽降解能力，其中4株乳酸菌的亞硝酸鹽降解能力較弱，降解率＜60%，其中，菌株通渭A8的亞硝酸鹽降解率最低，為21.33%；6株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率為60%～70%，占總數的17.1%；7株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率為70%～80%，占總數的20%；13株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率為80%～90%，占總數的37.1%；5株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率＞90%，占總數的14.3%，其中，菌株通渭A7的亞硝酸鹽降解率最高，為93.81%，菌株天水A14的亞硝酸鹽降解率次之，為93.51%，菌株平涼4的亞硝酸鹽降解率為93.40%，菌株武都A1的亞硝酸鹽降解率為91.85%，菌株定西4的亞硝酸鹽降解率為91.83%，故選擇亞硝酸鹽降解率高的這5株乳酸菌進行菜用枸杞漿水的發(fā)酵。

表4 35株乳酸菌菌株的亞硝酸鹽降解率及發(fā)酵液的pH值Table 4 Nitrite degradation rate and pH of fermentation broth of 35 strains of lactic acid bacteria

空白培養(yǎng)基的pH值為6.43，接種乳酸菌后培養(yǎng)液pH明顯下降，但這35株乳酸菌接種72 h后培養(yǎng)液pH值波動范圍不大，其范圍為3.91～4.07，pH均接近4左右，能在發(fā)酵過程中提供較好的酸性環(huán)境，抑制雜菌的生長，增加了這些菌株運用于漿水發(fā)酵的可能性。

乳酸菌作為漿水發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌[18]，具有降膽固醇[19]、降尿酸[20]、抑菌性[21]等功能，可發(fā)酵產酸、細菌素等多種抑菌物質，能夠抑制和殺死發(fā)酵食品中的腐敗菌和致病菌[22]。本研究分離得到的乳酸菌不僅能迅速降低漿水的pH值，還能降解亞硝酸鹽，說明漿水中蘊藏著豐富而獨特的微生物資源，有待進一步挖掘。

2.3 可降解亞硝酸鹽乳酸菌菌株應用于菜用枸杞發(fā)酵漿水的潛力評估

2.3.1 菜用枸杞漿水的感官評價

5株乳酸菌發(fā)酵菜用枸杞漿水的感官評價結果見圖1。由圖1可知，對照組菜用枸杞漿水的色澤、風味、口感分值最低，漿水有明顯臭味，酸敗嚴重并且表面白膜嚴重，而菌株天水A14發(fā)酵的漿水綜合評分最高，寧強引子次之。除對照組外，在口感方面，菌株通渭A7和武都A1發(fā)酵的漿水在口感上差異性不大，其他3株乳酸菌發(fā)酵的漿水在口感上差異性較大，接種菌株天水A14發(fā)酵的漿水口感最好，漿水菜有一定的脆度，分值最高，評分為41.67分。添加寧強引子發(fā)酵的漿水味道醇厚，可能是因為添加的寧強引子中含有酵母菌，混菌發(fā)酵的緣故。菌株定西4發(fā)酵的漿水口感評分最差，其分值為27.77分。在風味方面，接種菌株天水A14和平涼4發(fā)酵的漿水風味最佳，酸香味濃郁且具有菜用枸杞的清香味，菌株定西4發(fā)酵的漿水風味最差，分值為16.03分。在色澤方面，寧強引子發(fā)酵的漿水呈嫩黃色，半透明且有光澤。接種菌株天水A14和通渭A7發(fā)酵的漿水為嫩黃色，有色澤，漿水清澈。菌株定西4發(fā)酵的漿水色澤最差，感官評分為12.63分。經過綜合評價后，菌株天水A14發(fā)酵的菜用枸杞漿水的感官評分最高，為91.67分，菌株定西4發(fā)酵的菜用枸杞漿水的感官評分最差，為56.43分，說明菌株天水A14更適用于菜用枸杞漿水的發(fā)酵。

圖1 各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水感官評價結果Fig.1 Sensory evaluation results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.2 菜用枸杞漿水中亞硝酸鹽含量的測定

菜用枸杞漿水發(fā)酵結束后，測定亞硝酸鹽含量，結果見圖2。由圖2可知，5株乳酸菌均能顯著降解亞硝酸鹽含量（P＜0.05）。對照組中亞硝酸鹽含量最高，為10.43 mg/kg，高于地方標準DB51/T975—2009《四川泡菜》中對亞硝酸鹽限量為10 mg/kg的標準。菌株平涼4發(fā)酵的漿水亞硝酸鹽含量最低，為0.56 mg/kg，而菌株定西4發(fā)酵的漿水中亞硝酸鹽含量高于寧強引子發(fā)酵的漿水，其亞硝酸鹽含量為4.12 mg/kg，高于農業(yè)行業(yè)標準NY/T 437—2012《綠色食品醬腌菜》中對亞硝酸鹽的限量為4 mg/kg的標準。菌株通渭A7、天水A14、武都A1和平涼4發(fā)酵的漿水中亞硝酸鹽含量均低于寧強引子發(fā)酵的漿水，且亞硝酸鹽含量均在其限定安全范圍內，表明這4株乳酸菌在菜用枸杞漿水發(fā)酵過程中同樣具有降解亞硝酸鹽的能力。

圖2 各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水中亞硝酸鹽含量的測定結果Fig.2 Nitrite content determination results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.3 菜用枸杞漿水中總酸含量的測定

乳酸菌在厭氧條件下利用糖類產生乳酸，提高漿水中的總酸含量[4]，各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水中的總酸含量見圖3。由圖3可知，菌株天水A14發(fā)酵漿水的總酸含量最高，為0.28%，寧強引子發(fā)酵漿水的總酸含量最低，為0.16%。5株乳酸菌發(fā)酵的漿水的總酸含量均顯著高于寧強引子發(fā)酵的漿水，說明可降解亞硝酸鹽的乳酸菌在漿水發(fā)酵過程中的產酸能力較強。

圖3 各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水中總酸含量的測定結果Fig.3 Total acid content determination results of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

2.3.4 菜用枸杞漿水pH值的測定

各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水的pH值見圖4。由圖4可知，寧強引子發(fā)酵漿水的pH值最高，為4.18，而菌株武都A1發(fā)酵漿水的pH值最低，為3.68。5株菌株發(fā)酵漿水的pH值在3.68～3.86之間，各菌株在發(fā)酵過程沒有產酸能力特別突出的菌株，但能給漿水提供有利的酸性環(huán)境，有利于乳酸菌的生長。乳酸菌接種發(fā)酵后，漿水的pH值都比MRS液體培養(yǎng)基中pH值低，其原因可能是菜用枸杞漿水發(fā)酵時間比MRS液體培養(yǎng)基中的時間長，但與寧強引子發(fā)酵的漿水相比，篩選出的菌株發(fā)酵的漿水的pH值更低。

圖4 各菌株發(fā)酵菜用枸杞漿水的pH值Fig.4 The pH of Lycium barbarum Jiangshui fermented by different strains

此外，在漿水發(fā)酵過程中，低pH值有利于亞硝酸鹽的降解[4]。亞硝酸鹽的降解與酸性環(huán)境有關[5]，在發(fā)酵的前期，漿水中有其他菌種的參與，pH值較高，漿水中酸性物質含量少，漿水中的亞硝酸鹽含量增加，即漿水中的pH值趨向硝酸還原酶的最適pH時，硝酸還原酶活性和亞硝酸鹽含量均呈上升趨勢；在發(fā)酵中期，pH降低，乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，漿水中酸性物質增加，使得亞硝酸鹽含量下降。

2.3.5 菜用枸杞發(fā)酵前后活性成分含量的變化

菜用枸杞富含多糖、甜菜堿和黃酮類營養(yǎng)成分，測定菜用枸杞發(fā)酵前后這些功能性營養(yǎng)成分含量，判斷菜用枸杞漿水的營養(yǎng)功效，結果見圖5。因接種菌株定西4的菜用枸杞漿水的亞硝酸鹽含量超標，且感官評分較低，沒有可開發(fā)價值，故未進行多糖、甜菜堿和總黃酮含量測定。

圖5 菜用枸杞發(fā)酵前后多糖（a）、甜菜堿（b）及總黃酮（c）含量的變化Fig.5 Changes in polysaccharide (a),lycine (b) and total flavone (c) content before and after the fermentation of Lycium barbarum

由圖5a可知，菜用枸杞鮮樣的多糖含量為25.74 mg/g，接種發(fā)酵后，多糖含量呈現不同的變化趨勢。菌株通渭A7、天水A14發(fā)酵菜用枸杞中的多糖含量較鮮樣有少量的增加，接種寧強引子、菌株平涼4和武都A1發(fā)酵后的菜用枸杞中多糖含量較鮮樣有所降低，且菌株平涼4發(fā)酵后的菜用枸杞呈顯著水平（P＜0.05）。菌株通渭A7和天水A14發(fā)酵的菜用枸杞中多糖含量顯著高于寧強引子發(fā)酵的菜用枸杞（P＞0.05）。多糖含量升高的原因可能是菌株通渭A7、天水A14屬于產胞外多糖乳酸菌，在發(fā)酵過程中能產生多糖導致多糖含量上升，趙婧等[23-24]也有相似的研究報道。

由圖5b可知，菜用枸杞鮮樣中的甜菜堿含量為5.31mg/g，接種4株乳酸菌及寧強引子發(fā)酵后菜用枸杞后，甜菜堿含量均降低，且接種菌株武都A1發(fā)酵后的菜用枸杞甜菜堿含量（4.48 mg/g）下降顯著（P＜0.05），分析原因可能是菜用枸杞在漿水發(fā)酵前經過沸水熱煮處理造成的甜菜堿損失。

由圖5c可知，菜用枸杞鮮樣中總黃酮的含量為0.80mg/g，接種菌株武都A1發(fā)酵后的菜用枸杞總黃酮含量（0.67 mg/g）較鮮樣顯著降低（P＜0.05）。接種通渭A7、平涼4發(fā)酵的菜用枸杞中總黃酮含量較鮮樣僅有少量的減少，無顯著性差異（P＜0.05）。接種菌株天水A14發(fā)酵的菜用枸杞中總黃酮的含量顯著高于鮮樣中總黃酮含量（P＜0.05），分析原因可能是由于菌株天水A14在發(fā)酵過程中分泌的代謝物作用于前體物質轉化為黃酮類物質造成的，這與黃玉軍等[25-26]的研究結果相似。

3 結論

本試驗從9份不同來源的漿水中分離得到35株乳酸菌，經鑒定，29株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），3株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），3株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。復篩得出5株具有高效降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌，亞硝酸鹽降解率＞90%，將其應用于菜用枸杞漿水發(fā)酵，結果發(fā)現，接種菌株天水A14發(fā)酵的菜用枸杞漿水外觀澄清半透明、風味突出、有濃郁的菜用枸杞香味，酸度適中，感官綜合評分最高（91.67分），漿水中亞硝酸鹽含量為1.74 mg/kg，總酸含量為0.28%，pH值為3.69。對發(fā)酵前后菜用枸杞中活性成分進行測定，結果發(fā)現，接種菌株天水A14發(fā)酵漿水菜中多糖含量為26.92 mg/g，總黃酮含量0.92 mg/g，較發(fā)酵前鮮樣含量增加。綜上，菌株天水A14為優(yōu)良菌株，其既能高效降解亞硝酸鹽，同時發(fā)酵的菜用枸杞漿水品質優(yōu)良，可作為漿水發(fā)酵功能性菌株的候選菌株。