克雷伯氏菌乙醛脫氫酶基因過(guò)表達(dá)及產(chǎn)乙醇發(fā)酵工藝優(yōu)化

查 凡，周 柱，張 琴*，陳 振，陳翔宇，胡永安

（安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

進(jìn)入21世紀(jì)，以石油為主的化工煉制方式已不能滿(mǎn)足全球經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展的需求，以可再生資源為基礎(chǔ)的生物基化學(xué)品煉制日益興起。乙醇是目前生物煉制領(lǐng)域相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要生物能源產(chǎn)品之一，可作為高辛烷值燃料和燃油增氧劑添加至汽油中使用，不僅能夠提供與汽油相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)能，還能提高汽油的抗爆性，降低汽車(chē)尾氣排放，被認(rèn)為是一種極具潛力的化石能源替代品[1]。隨著市場(chǎng)需求的增加，第二代纖維素燃料乙醇在原料成本和政策方面已頗具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因而成為生物能源企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)[2]。

近年來(lái)，木質(zhì)纖維素資源作為一種地球上廣泛存在且可持續(xù)利用的生物質(zhì)資源，以其為原料生產(chǎn)乙醇已成為燃料乙醇領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3-6]。如何提高過(guò)程效率、降低生產(chǎn)成本是關(guān)乎纖維素乙醇高效生產(chǎn)的重點(diǎn)，亦是決定其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是用于乙醇發(fā)酵的主要微生物菌株，但其不能分解利用纖維素，亦不能有效轉(zhuǎn)化利用木質(zhì)纖維素水解液中的木糖[7-8]，使其在纖維素燃料乙醇生產(chǎn)中不具優(yōu)勢(shì)。

乙醛脫氫酶是乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在真核生物（如人、酵母菌）中，乙醛脫氫酶是催化乙醇降解的關(guān)鍵酶[9-10]。然而，在原核生物中，乙醛脫氫酶在不同的物種中發(fā)揮不同的功能，有研究表明，乙醛脫氫酶可催化芽孢桿菌（Bacillussp.）中乙酸的合成[11]；而在具有混合酸發(fā)酵途徑的兼性厭氧細(xì)菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）中，乙醛脫氫酶主要催化乙酸和乙醇合成的代謝支路，對(duì)乙醇的合成亦起到一定的促進(jìn)作用[12-15]；HONG W K等[16]在多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中表達(dá)了來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶基因，使得乙醇產(chǎn)量較之野生菌株提高3.3倍；MANOW R等[17]在產(chǎn)乙醇大腸桿菌RM10中表達(dá)了乙醛脫氫酶基因aldB，使其發(fā)酵木糖的乙醇產(chǎn)量明顯提高。本研究中的克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316為一株具備混合酸發(fā)酵途徑的兼性厭氧細(xì)菌，已報(bào)道能利用木質(zhì)纖維素水解液中葡萄糖和木糖合成生物氫[18-20]，在其發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程中，乙醇亦有較高的積累量[19-20]。

為此，本研究基于克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316的全基因組信息[21]，擬通過(guò)同源過(guò)表達(dá)其乙醇合成途徑中的關(guān)鍵酶—乙醛脫氫酶基因aldh，實(shí)現(xiàn)該菌株乙醇合成代謝途徑的強(qiáng)化，獲得既能有效利用木質(zhì)纖維素水解糖液又能高效合成乙醇的工程菌株，并通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)重組菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)乙醇的重組菌株及其最優(yōu)發(fā)酵工藝，對(duì)纖維素乙醇的高效廉價(jià)開(kāi)發(fā)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。試驗(yàn)中用于乙醛脫氫酶aldh基因克隆和亞克隆的引物見(jiàn)表1，引物的合成和后續(xù)的基因測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 用于aldh基因克隆和亞克隆的引物及序列Table 1 Primers and sequences for aldh gene cloning and subcloning

1.1.2 試劑

NotI、XhoI限制性核酸內(nèi)切酶、T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶、DL5 000 DNA Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、T載體聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物克隆試劑盒、TaqPCR Master Mix、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、TureColor雙色預(yù)染蛋白Marker、細(xì)菌總蛋白提取試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；K-ETOH乙醇檢測(cè)試劑盒：愛(ài)爾蘭Megazyme公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基[17]：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g。

活化和種子培養(yǎng)基[19-20]：D-木糖10 g，葡萄糖10 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 1 g，pH7.5，蒸餾水1 000 mL，110 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[16-17]：稻草水解液（初始還原糖質(zhì)量濃度50 g/L）1 000 mL，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）1 mmol/L，pH值7.5，110 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

T100梯度PCR儀、SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼公司；754PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華儀器有限公司；Scientz IID超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-100C恒溫金屬浴：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MultiskanTMFC酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1Klebsiellasp.WL1316乙醛脫氫酶aldh基因的克隆和亞克隆

作為具有混合酸發(fā)酵途徑的兼性厭氧細(xì)菌，乙醛脫氫酶為調(diào)控Klebsiellasp.WL1316合成乙酸和乙醇代謝支路的關(guān)鍵酶[21]，該菌株已進(jìn)行全基因組測(cè)序[21]，且其基因組數(shù)據(jù)已提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的SRA（sequence read archive）數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得BioProject登錄號(hào)PRJNA611005。為此，基于該菌株基因組數(shù)據(jù)的功能蛋白預(yù)測(cè)和基因注釋?zhuān)槍?duì)乙醛脫氫酶大亞基基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并命名該基因?yàn)橐胰┟摎涿竌ldh基因。

采用細(xì)菌基因組DNA抽提純化試劑盒提取克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）WL1316的基因組DNA，以此作為模板，采用引物對(duì)ALF1/ALR1 PCR擴(kuò)增aldh基因，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化目的基因，連接pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再涂布于含20 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)14 h。獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的即為所需陽(yáng)性克隆。采用引物對(duì)ALF12/ALR12 PCR擴(kuò)增含NotI、XhoI酶切位點(diǎn)的aldh基因，實(shí)現(xiàn)aldh基因的亞克隆，連接pUCm-T載體，按上述方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Es-cherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的克隆子aldh-pUCm-T-Escherichia coliDH5α。

1.3.2 重組質(zhì)粒aldh-pET-28a的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證

從aldh-pUCm-T-Escherichia coliDH5α中提取aldhpUCm-T克隆質(zhì)粒，采用NotI/XhoI進(jìn)行雙酶切并純化目的基因，與同樣雙酶切且純化的pET-28a載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒aldh-pET-28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布于含10 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃條件下培養(yǎng)14 h，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)菌液PCR得到重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得正確的轉(zhuǎn)化子aldh-pET-28a-Escherichia coliDH5α。

1.3.3 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株的構(gòu)建

從構(gòu)建成功的aldh-pET-28a-Escherichia coliDH5α中提取重組質(zhì)粒aldh-pET-28a，采用CaCl2法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Klebsiellasp.WL1316感受態(tài)細(xì)胞，涂布含10 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃條件下培養(yǎng)14 h，獲得轉(zhuǎn)化子，并抽提質(zhì)粒，再進(jìn)行雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株即為研究所得的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。

1.3.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE電泳檢測(cè)

將過(guò)表達(dá)aldh基因的重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316和野生菌Klebsiellasp.WL1316分別接種于LB固體培養(yǎng)基（重組菌的培養(yǎng)基中加10μg/mL卡那霉素），37℃條件下活化16 h；挑單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基（重組菌的培養(yǎng)基中加10 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜；取培養(yǎng)好的菌液5mL接種于新鮮的100 mL LB液體培養(yǎng)基（重組菌的培養(yǎng)基中加10 μg/mL卡那霉素）中，野生菌在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)8 h；重組菌在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 h時(shí)，在重組菌發(fā)酵液中加入無(wú)菌的IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃、180 r/min條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。取20 mL菌液8 000 r/min條件下離心5 min，收集菌體，采用細(xì)菌總蛋白提取試劑盒提取菌體中的總蛋白；采用SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇過(guò)程的研究

挑取活化好的野生菌Klebsiellasp.WL1316和過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的單菌落，分別接種于3 mL種子培養(yǎng)基（重組菌的培養(yǎng)基中加10 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12～14 h作為一級(jí)種子液；按10%（V/V）的接種量將一級(jí)種子液接種于30 mL種子培養(yǎng)基（重組菌的培養(yǎng)基中加10 μg/mL卡那霉素）中，野生菌在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)8 h，作為二級(jí)種子液；重組菌在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 h時(shí)，加入無(wú)菌的IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃、180 r/min條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，作為二級(jí)種子液。將二級(jí)種子液按10%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，之后轉(zhuǎn)入第二段厭氧發(fā)酵，37 ℃靜置發(fā)酵至72 h。每12 h取發(fā)酵液，8 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，采用K-ETOH乙醇檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乙醇含量，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]檢測(cè)葡萄糖含量，采用地衣酚比色法[23]檢測(cè)木糖含量，并計(jì)算葡萄糖和木糖利用率，其計(jì)算公式如下：

1.3.6 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：按照1.3.5的方法依次考察IPTG濃度（0、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）和初始還原糖含量（25 g/L、50 g/L、75 g/L、100 g/L）對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，以IPTG濃度（A）、初始pH值（B）及初始還原糖含量（C）為考察因素，采用Design-Expert 12.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for process optimization of ethanol production from rice straw hydrolysate by gene recombinant strain of overexpressing aldh gene

2 結(jié)果與分析

2.1 Klebsiella sp.WL1316乙醛脫氫酶基因aldh的克隆和亞克隆

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)aldh基因克隆和亞克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度均約為1 000 bp，與預(yù)期目標(biāo)條帶大小相符，表明獲得了這個(gè)基因的克隆和亞克隆產(chǎn)物?？寺『蛠喛寺CR擴(kuò)增產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)一步篩選獲得的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，該aldh基因序列與肺炎克雷伯菌（Kleb siella pneumoniae）（GenBank登錄號(hào)：WP_117070081.8）的乙醛脫氫酶基因序列的一致性達(dá)100%，并與Klebsiellasp.WL1316的基因組解析結(jié)果完全一致，說(shuō)明克隆獲得了序列正確的aldh基因。

圖1 aldh基因克?。╝）和亞克?。╞）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of aldh gene clones (a) and subclones (b)

2.2 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株的構(gòu)建

提取陽(yáng)性克隆的aldh-pUCm-T質(zhì)粒，雙酶切并純化目的基因，與同樣雙酶切的pET-28a載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選，獲得重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。提取重組表達(dá)質(zhì)粒aldh-pET-28a，采用NotI/XhoI進(jìn)行雙酶切，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒aldh-pET-28a雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Determination results of agarose gel electrophoresis of double digestion products of recombinant expression plasmid aldh-pET-28a

由圖2可知，獲得了堿基長(zhǎng)度正確的目的條帶，表明得到正確的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316。

2.3 aldh基因的同源過(guò)表達(dá)

重組菌株通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 目的蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoretic diagram of target protein

理論上，aldh基因序列翻譯后的目的蛋白分子質(zhì)量應(yīng)該為32.8 kDa，由圖3可知，在分子質(zhì)量接近35 kDa處出現(xiàn)了條帶，并較之野生菌有一定加深，初步表明該乙醛脫氫酶基因在Klebsiellasp.WL1316中實(shí)現(xiàn)了同源過(guò)表達(dá)。

2.4 重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiella sp.WL1316發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇過(guò)程的研究

有研究表明，乙醛脫氫酶表達(dá)量越高，乙醇產(chǎn)量越高[17]。為研究aldh基因表達(dá)對(duì)菌株乙醇合成及稻草水解液中葡萄糖和木糖的利用動(dòng)態(tài)，本研究對(duì)重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316和野生菌Klebsiellasp.WL1316發(fā)酵72 h內(nèi)的乙醇產(chǎn)量及葡萄糖和木糖利用率的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，在菌株發(fā)酵過(guò)程中，乙醇呈動(dòng)態(tài)積累的趨勢(shì)，可能是由于菌株中存在不同功能乙醛脫氫酶，使得菌株乙醇產(chǎn)量在一定發(fā)酵階段達(dá)到峰值。當(dāng)重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發(fā)酵至60 h時(shí)，乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高，為（4.92±0.03）g/L，較野生菌Klebsiellasp.WL1316提高18.3%，可推測(cè)菌株中過(guò)表達(dá)aldh基因有利于乙醇在60 h的積累，為此，選擇60 h為適宜的發(fā)酵時(shí)間。由圖4B亦可知，重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的葡萄糖和木糖利用率和野生菌Klebsiellasp.WL1316的無(wú)顯著差異（P＜0.05），由此可認(rèn)為，重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316保持了野生菌Klebsiellasp.WL1316利用木質(zhì)纖維素水解液中葡萄糖和木糖的能力，aldh基因的表達(dá)并未降低其糖利用效率。

圖4 重組菌和野生菌的乙醇產(chǎn)量（A）和還原糖利用率（B）Fig.4 Ethanol production (A) and reducing sugar utilization rate (B)of recombinant strain and wild strain

2.5 過(guò)表達(dá)aldh基因重組菌株發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn)

IPTG濃度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值和初始還原糖含量對(duì)重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發(fā)酵稻草水解液生產(chǎn)乙醇的影響見(jiàn)圖5。

圖5 IPTG濃度（A）、初始pH值（B）及初始還原糖含量（C）對(duì)重組菌株發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration (A),initial pH (B) and initial reducing sugar content (C) on ethanol production from rice straw hydrolysate fermented by recombinant strain

在原核基因表達(dá)過(guò)程中，誘導(dǎo)劑能夠提高重組蛋白的整體表達(dá)量[17]。由圖5A可知，IPTG誘導(dǎo)濃度在0.5～2.0 mmol/L范圍內(nèi)，乙醇產(chǎn)量較未誘導(dǎo)菌株的均顯著提高（P＜0.05），尤以1.0 mmol/L的誘導(dǎo)菌株效果最好，其乙醇產(chǎn)量可達(dá)（4.90±0.05）g/L，較未誘導(dǎo)的提高35.00%。因此，選擇IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L。

由圖5B可知，在1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316在初始pH6.5～8.5的范圍內(nèi)均能有效地合成乙醇，乙醇產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為7.5時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高，為（4.92±0.03）g/L。因此，選擇pH7.5為最適宜的發(fā)酵初始pH值。

由圖5C可知，在IPTG誘導(dǎo)濃度和發(fā)酵初始pH值固定為1.0 mmol/L和7.50條件下，重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316在初始還原糖含量為25～100 g/L范圍內(nèi)，乙醇產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是初始還原糖含量較低可能引起碳源不足，但初始還原糖含量過(guò)高又會(huì)對(duì)乙醇的積累起到一定的抑制作用。當(dāng)初始還原糖含量為50 g/L時(shí)，乙醇產(chǎn)量最高，為（4.99±0.59）g/L。因此，選擇50 g/L為最佳的初始還原糖含量。

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 12.0軟件對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316乙醇含量的二次多元回歸方程如下：

由表4可知，模型顯著（P＜0.05），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明建立的模型擬合程度良好。決定系數(shù)R2可對(duì)模型的精確性和變異性進(jìn)行評(píng)估[24-25]，本模型的R2為0.853 7，表明實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間呈較顯著的相關(guān)關(guān)系，響應(yīng)值的大多數(shù)變化都能通過(guò)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表4亦可知，二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B和二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

采用Design-Expert 12.0軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇的最佳工藝條件為：IPTG誘導(dǎo)濃度1.45 mmol/L，初始pH值7.29，初始還原糖含量59.10 g/L，乙醇產(chǎn)量理論值為5.11 g/L。為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)發(fā)酵工藝修正為IPTG濃度1.5 mmol/L，初始pH值7.3，初始還原糖含量59 g/L，采用最優(yōu)發(fā)酵工藝得到重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316的乙醇產(chǎn)量實(shí)際值為（5.39±0.51）g/L，與理論值接近，是同等發(fā)酵條件下野生菌Klebsiellasp.WL1316乙醇產(chǎn)量[（3.67±0.32）g/L]的1.47倍，可見(jiàn)aldh基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了乙醇產(chǎn)量的提高，這與OH B R等[26]報(bào)道的在肺炎克雷伯氏菌中過(guò)表達(dá)乙醛/乙醇脫氫酶AdhE基因的促乙醇合成效果類(lèi)似，由此也證明了本研究基因操作策略的可行性。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了同源過(guò)表達(dá)aldh基因的重組菌株aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316，其發(fā)酵稻草水解液60 h時(shí)的乙醇含量較野生菌株提高18.3%，并保持了野生菌株利用木質(zhì)纖維素水解液中葡萄糖和木糖的特性，這對(duì)于纖維素乙醇的生產(chǎn)至關(guān)重要。通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得到重組菌aldh-pET-28a-Klebsiellasp.WL1316發(fā)酵稻草水解液產(chǎn)乙醇的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間60 h，IPTG濃度1.5 mmol/L，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.3，初始還原糖含量59 g/L，在此最優(yōu)工藝條件下，乙醇產(chǎn)量為（5.39±0.51）g/L，較同等發(fā)酵條件下野生菌株Klebsiellasp.WL1316的乙醇產(chǎn)量[（3.67±0.32）g/L]提高47%?？梢?jiàn)，本研究對(duì)纖維素乙醇發(fā)酵生產(chǎn)基因重組菌株的研發(fā)及乙醇燃料的高效廉價(jià)開(kāi)發(fā)具有重要的理論和實(shí)踐意義。