抗副溶血弧菌海洋微生物的篩選、鑒定及抑菌譜研究

徐麓凱，劉一平，韓袁彤，黃楊竹，石悅煒，金黎明*

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，遼寧 大連 116600；2.東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，遼寧 沈陽 110169）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是弧菌科（Vibrionaceae）的一種常見細(xì)菌，大量存在于海水等高鹽環(huán)境中，已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的首要致病菌[1-3]。在我國沿海城市的海水及海產(chǎn)品（海魚、蝦、蟹、墨魚等）中，副溶血弧菌一直是檢出率較高的致病菌之一，尤其是7、8月份。近年來，副溶血弧菌已成為包括中國、美國等在內(nèi)的全球沿海國家海產(chǎn)品食物中毒事件暴發(fā)的首要原因[4-5]。為防止副溶血弧菌引起的感染和養(yǎng)殖業(yè)損失，人們在養(yǎng)殖過程中長期使用抗生素，導(dǎo)致副溶血弧菌菌株的抗藥性不斷增強(qiáng)[6]。據(jù)報道，副溶血弧菌對臨床上常見的抗生素氨芐西林有最高的耐藥性，其次對磺胺類藥物如磺胺甲惡唑及大環(huán)內(nèi)酯類及四環(huán)霉素類藥物也出現(xiàn)了明顯的抗藥性，有些分離于養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌甚至對在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用頻率很低的藥物紅霉素出現(xiàn)了耐藥性問題[7]。

海洋微生物長期處于高壓、高鹽、無光照等特殊環(huán)境中，因此具備了獨(dú)特的生存策略，也許會產(chǎn)生罕見的代謝產(chǎn)物來協(xié)助自身生存，而這些特殊產(chǎn)物則可能會在醫(yī)藥方面發(fā)揮巨大優(yōu)勢。目前，對海洋微生物資源的探索和次級代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)之一[8]，而深海來源的芽孢桿菌屬（Bacillus）物種因能產(chǎn)生大量酶和抗生素等，而被許多學(xué)者看作是優(yōu)質(zhì)益生菌[9]。如羅曼等[10]從南極沉積物樣品中分離純化出一株枯草芽孢桿菌斯氏亞種（Bacillus subtilissubsp.spizizenii），對植物致病菌如層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）有較強(qiáng)抑制效果；ZHOU Y等[11]從南大西洋的深海沉積物中分離篩選得到一株能抑制曲霉突變株菌絲生長的環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans），且該菌對黃曲霉毒素前體的積累有阻礙作用。

針對當(dāng)前存在的副溶血弧菌的耐藥性問題，本研究以生物抗菌活性為導(dǎo)向，采用涂布平板法和平板劃線法從印度洋沉積物樣品中分離純化并篩選抑制副溶血弧菌生長的菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗及16S rDNA基因序列分析對其進(jìn)行菌種鑒定，并對其抑菌譜進(jìn)行研究，為后期從海洋微生物中探索得到高效力抗菌活性物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

西南印度洋沉積物樣品（水深1 783 m）：自然資源部第三海洋研究所。

1.1.2 菌株

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）CGMCC 1.1616、大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CICC 21484、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）BNCC 194496、屎腸球菌（Enterococcus faecium）BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）BNCC 186113、白色念珠菌（Candida albicans）CMCC 52201：本實(shí)驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂30 g/L。

LB海水培養(yǎng)基[12]：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，海水1 000 mL。LA海水固體培養(yǎng)基：在LB海水培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g。

LB固體培養(yǎng)基[12]：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

腦心浸出（brain heart infusion，BHI）固體培養(yǎng)基[12]：胰蛋白胨20 g，牛心浸粉10 g，NaCl 10 g，葡萄糖4 g，磷酸氫二鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

MRS培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、吐溫80 1 mL、檸檬酸氫三銨2 g、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g、瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。

葡萄糖蛋白胨酵母膏（glucose peptone yeast extract，GPY）海水培養(yǎng)基[13]：蛋白胨2 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。

2216E海水培養(yǎng)基[14]：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸鐵0.1 g，瓊脂20 g，海水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試劑

瓊脂（生化試劑）：廣州賽國生物科技有限公司；氯化鈉（分析純）、酵母提取物（生化試劑）、葡萄糖（分析純）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、SanPrep柱式脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）、瓊脂糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌器：日本HIRAYAMA公司；BSA224S電子天平：德國Sartorius公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：日本Airtech公司；SPX培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；VeritiTMDx PCR儀：基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海洋微生物的分離及純化

采用稀釋涂布平板法[15]和平板劃線法[12]分離印度洋沉積物中的微生物，取1 g樣品加入9 mL經(jīng)過滅菌的陳海水中，振蕩2 h后靜置，按10倍梯度依次稀釋至10-7。取稀釋度為10-7、10-6、10-5的樣品各50 μL均勻涂布于LA海水培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d。選取形態(tài)不同的微生物反復(fù)平板劃線，得到純化后的單菌落，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后與甘油混合，編號，保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 副溶血弧菌拮抗菌株的篩選

初篩：采用平板劃線法對海洋微生物進(jìn)行初篩。將副溶血弧菌以1%（V/V）的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液以0.1%（V/V）的接種量加入LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，凝固后，從待測菌株的平板中挑適量菌體，劃線到含有副溶血弧菌的培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)12 h后，觀察其抑菌效果。

復(fù)篩：采用瓊脂擴(kuò)散法[16]進(jìn)行復(fù)篩。將副溶血弧菌培養(yǎng)液以0.1%（V/V）的接種量加入LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，待平板凝固后打孔，將400 μL初篩后的海洋微生物粗發(fā)酵液加入孔中，37 ℃條件培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑，試驗重復(fù)三次。

1.3.3 副溶血弧菌拮抗菌株的鑒定

（1）形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗

將篩選得到的副溶血弧菌拮抗菌株劃線接種于LA海水培養(yǎng)基中，觀察其形態(tài)特點(diǎn)，再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]對其生理生化特征進(jìn)行鑒定，包括革蘭氏染色、糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗等。

（2）分子生物學(xué)鑒定

選取通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACG-3'），采用菌落PCR法對篩選得到的副溶血弧菌拮抗菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增[19]。PCR擴(kuò)增體系：模板7 μL，細(xì)菌通用引物27F和1492R各2 μL，2×TaqPlus Master Mix酶25 μL，雙蒸水（ddH2O）14 μL，總體積為25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.4 抑菌譜研究

采用瓊脂擴(kuò)散法探究菌株濃縮發(fā)酵液對各種致病菌的抑制效果[20]。首先以0.1%（V/V）的接種量將篩選得到的副溶血弧菌拮抗菌株接種于LB海水培養(yǎng)基中，37 ℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取其上清液旋轉(zhuǎn)濃縮100倍，并通過0.22 μm的無菌微孔濾膜過濾后放到無菌離心管中。將致病菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h，其中鮑曼不動桿菌使用BHI培養(yǎng)基、肺炎克雷伯氏菌使用NB培養(yǎng)基、屎腸球菌使用MRS培養(yǎng)基，其他致病菌均使用LB培養(yǎng)基，取100 μL致病菌種子液，與55 ℃左右相應(yīng)的40 mL培養(yǎng)基混勻，倒平板，凝固后用直徑為12 mm的打孔器打孔，并加入300 μL濃縮發(fā)酵液，三份平行，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離及純化

從印度洋沉積物樣品中共分離得到115株海洋微生物。

2.2 副溶血弧菌拮抗菌株的篩選

2.2.1 初篩結(jié)果

以副溶血弧菌為指示菌，經(jīng)初篩得到10株具有拮抗效果的菌株，其中4株菌株的抑菌效果較好，編號分別為NO.410、NO.4542、NO.4622、NO.5.10.1-1。

2.2.2 復(fù)篩結(jié)果

采用瓊脂擴(kuò)散法對4株抑菌效果較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株NO.5.10.1-1的抑菌圈直徑最大，達(dá)到（18.50±0.28）mm。杜靜芳等[21]研究結(jié)果顯示，從魚腸道中分離得到的5株乳酸菌對副溶血弧菌ATCC17802的平均抑菌圈直徑為17.9 mm；趙彩春等[22]從蝦養(yǎng)殖場水體中分離得到一株短小芽孢桿菌，該菌對副溶血弧菌的抑菌圈直徑為15.16 mm。由此可見，NO.5.10.1-1對副溶血弧菌的抑菌效果較好。因此，對該菌株進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表1 4株副溶血弧菌拮抗菌株的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameter of 4 Vibrio parahemolyticus antagonistic strains

2.3 菌株NO.5.10.1-1的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

菌株NO.5.10.1-1的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株NO.5.10.1-1呈乳白色，半透明，粘稠易挑起，表面光滑有光澤，單菌落呈圓形，中央凸起，菌落較小，有臭味。其鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性菌，菌體為桿狀。

圖1 菌株NO.5.10.1-1的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain NO.5.10.1-1

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌株NO.5.10.1-1的生理生化試驗結(jié)果見表2。由表2可知，菌株NO.5.10.1-1的葡萄糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗結(jié)果均為陰性，明膠液化試驗、接觸酶試驗、V-P試驗、淀粉水解試驗、尿素試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽試驗結(jié)果均為陽性。結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]，初步判定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株NO.5.10.1-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NO.5.10.1-1

2.3.3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株NO.5.10.1-1的16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在1 700 bp左右出現(xiàn)目的條帶，符合預(yù)期結(jié)果，說明PCR成功擴(kuò)增出了目標(biāo)序列。

圖2 菌株NO.5.10.1-1 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification product of 16S rDNA sequence of strain NO.5.10.1-1

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株NO.5.10.1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株NO.5.10.1-1與中村芽孢桿菌（Bacillus nakamurai）聚在同一分支，親緣關(guān)系最為接近，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化特征，最終將該菌株鑒定為中村芽孢桿菌（Bacillus nakamurai）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株NO.5.10.1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NO.5.10.1-1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 菌株NO.5.10.1-1的抑菌譜

近年來，海洋來源芽孢桿菌在抗菌方面?zhèn)涫荜P(guān)注，如方佩等[23]研究發(fā)現(xiàn)，從渤海潮間帶鹽地堿蓬中分離得到的1株海洋芽孢桿菌，對黃瓜灰霉病菌有很好的防治效果；陳靜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，從連云港海泥中分離出的1株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）chenj-1能夠有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖的病原菌—凡隆氣單胞菌；方衛(wèi)東等[25]從福建海水養(yǎng)殖區(qū)底泥中分離得到的海洋地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）FA08，對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌等致病菌有生長抑制作用。菌株NO.5.10.1-1抑菌譜的測定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株NO.5.10.1-1除了對金黃色葡萄球菌無抑制效果外，對7株常見的致病菌大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌均有抑制作用，可見該菌具有廣譜的抑菌性，是一株具有廣闊研究前景的海洋芽孢桿菌。

表3 菌株NO.5.10.1-1抑菌譜的測定結(jié)果Table 3 Determination results of antibacterial spectrum of strain NO.5.10.1-1

3 結(jié)論

本研究以副溶血弧菌為指示菌，從印度洋沉積物中共分離出115株海洋微生物，其中10株對副溶血弧菌有抑制作用，抑菌效果最優(yōu)的為菌株NO.5.10.1-1，其抑菌圈直徑達(dá)（18.50±0.28）mm。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為中村芽孢桿菌（Bacillus nakamurai）。除金黃色葡萄球菌外，菌株NO.5.10.1-1對7種致病菌均有抑制作用，具有較廣的抑菌譜。