河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲理化性質(zhì)和微生物多樣性分析

王清龍，李海登，劉延波，李金紅，劉洪亮，王永華，韓素娜，潘春梅，*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 理學部，河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州 450046；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 河南省白酒風格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；6.河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；7.河南蔡洪坊酒業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463500）

濃香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的典型香型之一，在釀造上采用泥窖、固態(tài)、雙邊、多微發(fā)酵[1-2]；釀造過程中涉及到的微生物主要來源于大曲和窖泥，大曲一種自然積溫轉(zhuǎn)化并風干而成的多酶多菌多物質(zhì)的微生物生態(tài)制品，具有糖化發(fā)酵生香的作用[3]；大曲在制作上采用自然接種和開放式發(fā)酵，使其充分網(wǎng)羅制曲環(huán)境中的各種微生物，主要有細菌和真菌[4]；細菌是白酒釀造過程中一類重要的微生物[5]，是大曲中產(chǎn)蛋白酶和香味物質(zhì)的重要菌類，對后續(xù)發(fā)酵和風味成型均具有重要影響；真菌能夠產(chǎn)酒、產(chǎn)酶、產(chǎn)香[6]，其中霉菌為大曲提供糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解能力以及多種有機酸等物質(zhì)[7]，酵母菌為大曲提供發(fā)酵力，不僅主導了酒精的產(chǎn)生，而且產(chǎn)生大量風味化合物[8]。而在大曲制作過程中由于制曲環(huán)境、培菌管理、后期貯存方法的不同，也使不同酒企的大曲理化性質(zhì)和微生物群落組成存在差異[9]。因此，研究大曲理化性質(zhì)及微生物群落的結(jié)構(gòu)，是充分認識釀酒微生物資源，解析濃香型白酒發(fā)酵機理的前提和基礎(chǔ)。

高通量測序技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于釀酒微生物多樣性研究[10]，吳樹坤等[9]利用高通量測序技術(shù)分析四川不同地區(qū)濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)差異；SUN W等[11]利用高通量測序技術(shù)研究不同季節(jié)濃香型白酒酒醅的微生物群落演替；李靜心等[12]采用高通量測序技術(shù)對濃香型白酒高溫大曲和中高溫大曲進行微生物差異分析比較。大曲的理化性質(zhì)是反映大曲是否發(fā)酵成熟和大曲品質(zhì)優(yōu)劣的直接指標[13-14]，劉延波等[15]通過測定水分、酸度、糖化力、液化力、發(fā)酵力、氨基酸態(tài)氮、淀粉含量對賒店老酒三個等級的大曲進行比較研究，制定大曲評價體系；炊偉強等[16]報道瀘州老窖大曲優(yōu)級大曲中水分、酸度高，淀粉質(zhì)量分數(shù)低；優(yōu)級大曲中的液化酶、糖化酶、蛋白酶的活力均明顯高于普級大曲。邢鋼等[17]跟蹤測定3種不同溫度大曲制曲過程中理化指標的變化，結(jié)果表明由于大曲發(fā)酵溫度和制作工藝不同，造成了3種大曲之間糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力4個理化指標相差很大。微生物群落組成及理化性質(zhì)直接反映了大曲的品質(zhì)，對白酒的酒體和風味形成起到關(guān)鍵作用，是釀酒生產(chǎn)的關(guān)鍵一環(huán)。

目前研究大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的報道較多，但從大曲理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)組成相關(guān)性方面對河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲的研究鮮見報道。為探索河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲之間的異同，本研究采用理化分析結(jié)合高通量測序技術(shù)，研究河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)差異，并通過冗余分析（redundancy analysis，RDA）對理化指標和微生物群落結(jié)構(gòu)進行相關(guān)性分析，為中原地區(qū)制作濃香型白酒大曲建立質(zhì)量標準體系與微生物數(shù)據(jù)庫，對大曲的制作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品均為用于白酒生產(chǎn)的成品曲，分別取自河南南部、東部、西部、中部四個不同地方的知名酒企，編號為YA、YB、YC和YD，每個地區(qū)樣品取3個平行樣本做理化分析，將采集的樣品進行等量混合后提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。

氫氧化鈉、無水乙醇、無水葡萄糖、可溶性淀粉、碘、碘化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸、鹽酸（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；甲醛（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司等；FastDNA SPIN Kit for Soil（土壤基因組DNA提取試劑盒）：美國MP Biomedicals公司；DNA聚合酶AP221-02、Trans 15K DNA Marker：北京全式金生物技術(shù)公司；產(chǎn)物回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104分析天平（感量為0.000 1 g）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-25精密pH計：上海雷磁儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：方科儀器（常州）有限公司；NanoDrop 2000紫外可見分光光度計、ST16R高速冷凍離心機、PICO17小型臺式離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GeneAmp9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；QuantiFluorTM-ST DNA定量儀：美國Promega公司；Illumina Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標測定

大曲水分、酸度、糖化力、液化力、淀粉含量、酯化力指標：依據(jù)吳樹坤等[9,15]方法進行測定。

糖化力的定義：在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個單位（U），以mg/（g·h）表示。液化力的定義：在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個單位（U），以g/（g·h）表示。酯化力的定義：每50 g大曲在35 ℃，經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個單位（U），以mg/（g·h）表示。

1.3.2 高通量測序

（1）總DNA的提取

根據(jù)FastDNA SPIN Kit for Soil說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

（2）PCR擴增和產(chǎn)物回收

細菌16S rDNA V3-V4區(qū)的通用引物為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG-3'）；806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCT-3'）。真菌18S rDNA V5-V7區(qū)的通用引物為：SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）；1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）。

PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10min。PCR擴增體系：4μL5×FastPfu緩沖液，2μL2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs），0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，1 μL DNA模板（10ng/μL），雙蒸水（ddH2O）補至20 μL。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA純化回收試劑盒進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTMST進行檢測定量。文庫的建立和高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

（3）高通量測序結(jié)果分析

使用Uparse（version 7.0.1090 http：//drive5.com/uparse/）在97%序列同一性的閾值下將唯一序列分類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。采用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project,RDP）classifier（version 2.13 https：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，然后將來自每個聚類OTU的代表序列與Silva細菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫（Re lease138 http：//www.arb-silva.de）和Greengene細菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫（Release 13.5 http：//greengenes.secondgenome.com/）或Silva真菌18S rRNA數(shù)據(jù)庫（Release138 http：//www.arbsilva.de）進行比對，得到各樣本的群落物種組成。通過mothur（version1.30.2 https：//mothur.org/wiki/calculators/）計算α多樣性指數(shù)。

1.3.3 理化指標和微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

采用Origin 2021b中的redundancy analysis插件對細菌和真菌優(yōu)勢菌屬與理化指標進行冗余分析（redundancy analysis，RDA），對Pearson相關(guān)系數(shù)進行顯著性檢驗。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019、SPSS Statistics 21.0、SAS 9.2、Origin 2021b等統(tǒng)計繪圖軟件進行數(shù)據(jù)分析及繪圖，理化指標結(jié)果采用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲理化指標分析

由表1可知，四種不同地區(qū)濃香型白酒大曲樣品水分含量在9.7%～13.1%之間，液化力在（0.62～0.85）g/（g·h）之間，根據(jù)濃香型白酒大曲輕工行業(yè)標準QB/T 4259—2011《濃香大曲》，全部符合濃香型白酒大曲水分含量＜14.0%，液化力≥0.20 g/（g·h）的要求；在水分含量和液化力上YB大曲和YA、YC、YD大曲之間沒有顯著差異（P＞0.05），YC大曲和YD大曲之間沒有顯著差異（P＞0.05），但YC大曲液化力最高為0.85 g/（g·h），YA大曲和YC、YD大曲之間存在顯著差異（P＜0.05），YA大曲水分含量最高為13.1%，而液化力最低為0.62 g/（g·h）；濃香型白酒大曲的糖化力通常在（100～1 000）g/（g·h）范圍內(nèi)，四種大曲在糖化力上均符合要求，四種大曲在糖化力上均兩兩差異顯著（P＜0.05），YC大曲的糖化力最高達625 g/（g·h），四個樣品中YA大曲糖化力最低為485 g/（g·h）；酯化力上均兩兩差異顯著（P＜0.05），但YD大曲僅為22g/（g·h），酯化力最高的是YC大曲為224 g/（g·h）；四種大曲淀粉含量在（51.0～59.1）g/100 g之間，符合（50.0～65.0）g/100 g的標準，其中YB大曲與YA、YC、YD大曲差異顯著（P＜0.05），其淀粉含量也最高為59.1 g/100 g，YA、YC、YD大曲兩兩之間差異不顯著（P＞0.05）；酸度指標在（0.3～1.5）mmol/10 g范圍內(nèi)視為正常，YB大曲和YC、YD大曲差異不顯著（P＞0.05），YA大曲和YB大曲之間差異顯著（P＜0.05），YA、YC、YD大曲之間兩兩差異顯著（P＜0.05）。

表1 大曲樣品理化指標分析結(jié)果Table 1 Analysis results of physical and chemical indexes of Daqu samples

2.2 大曲樣品Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)是常用于衡量微生物群落多樣性，Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)常用來衡量微生物群落物種的多樣性和豐富度，以Shannon指數(shù)最為敏感，即數(shù)值越大，物種的多樣性越高。由表2可知，YA、YB、YC和YD四個大曲樣品細菌分別檢測出1 552、866、492和888個OTU，真菌分別檢測出11、14、10、15個OTU；四種大曲樣本YA、YC、YD和YB細菌的Chao1指數(shù)分別為1 569.13、504.00、918.61和872.84，與Ace指數(shù)所反映的物種豐富度結(jié)果一致，表明四種大曲樣本中YA大曲豐富度最高；YD大曲細菌Shannon指數(shù)最大為4.39、Simpson指數(shù)最小為0.045，基于兩種算法都表明該大曲樣本細菌群落多樣性最高；四種大曲樣本的細菌群落多樣性YD＞YA＞YB＞YC，物種豐富度YA＞YD＞YB＞YC。YA、YC、YD、YB真菌的Chao1、Ace指數(shù)分別為11、10、15、14，YD大曲真菌物種豐富度最高，YB大曲真菌Shannon指數(shù)最大為1.37、Simpson指數(shù)最小為0.394，基于兩種算法都表明該大曲樣本真菌群落多樣性最高，四種大曲樣本的真菌菌群落多樣性YB＞YC＞YD＞YA，物種豐富度YD＞YB＞YD＞YC；覆蓋率范圍99.7%～100.0%，反映本次測序結(jié)果代表了樣本中微生物的真實情況。

表2 大曲樣品中細菌及真菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial and fungal flora in Daqu samples

2.3 大曲樣品細菌群落組成分析

將各類OTU的代表序列與Silva細菌數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)每個OTU在不同分類水平的物種分類信息，分析不同分類水平上樣本群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1。

圖1 基于門水平的大曲樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure of Daqu samples at phylum level

由圖1可知，在細菌門水平上，四個樣品中共檢測出9個細菌門，相對豐度較高（＞1%）的細菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）；由于厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱和梭菌綱等微生物組成，能很好的適應(yīng)環(huán)境，能夠在外界條件極差的條件下保持生長代謝[18]；放線菌門菌群廣泛分布于土壤、海洋、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，與厚壁菌門相似，也具有極強的耐受性[19]。在對不同溫度大曲、不同產(chǎn)區(qū)大曲和釀造環(huán)境的高通量測序研究中均發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形桿菌門、放線菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門[9，20-23]，本實驗對濃香型白酒大曲中微生物多樣性的研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

四種不同大曲之間的門水平上細菌群落組成存在差異；YA、YC和YD大曲的第一優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（47.59%、59.18%和52.59%），第二優(yōu)勢菌門為變形菌門（24.40%、28.09%和30.20%）；YB大曲的第一優(yōu)勢菌門則是變形菌門（40.34%），第二優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（23.78%），其藍細菌門（12.24%）、放線菌門（9.94%）和擬桿菌門（7.37%）相對豐度明顯高于其他三種大曲；YD大曲綠彎菌門（4.67%）豐度最高；四種大曲中養(yǎng)菌門、熱袍菌門和酸桿菌門在各大曲中豐度不同，但都處于較低水平。

大曲中的細菌四個大曲樣本與細菌屬物種之間的對應(yīng)關(guān)系見圖2。由圖2可知，在屬水平上，四個樣本中共檢測到28個細菌屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、青枯菌屬（Ralstonia）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、阪崎腸桿菌（Cronobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、Microcystis_PCC-7914、魏斯氏菌屬（Weissella）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、norank_f__norank_o__Chloroplast、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、unclassified_p__Proteobacteria、喬治菌屬（Georgenia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、梭形桿菌屬（Lysinibacillus）、norank_of__Muribaculaceae、norank_of__Mitochondria、norank_of__norank_o__OPB56、norank_of__norank_o__SBR1031、unclassified_c__Anaerolineae、假單胞菌屬（Pseudomonas）、紫桿菌屬（Porphyrobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Mesotoga、Mariniradius。

圖2 基于屬水平的大曲樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of Daqu samples at genus level

在四種大曲中相對豐度較高（＞1%）的細菌屬有芽孢桿菌屬、青枯菌屬、高溫放線菌屬、Kroppenstedtia、紅球菌屬、阪崎腸桿菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、Microcystis_PCC-7914、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬；其中芽孢桿菌產(chǎn)多種水解酶[24]，可以分解淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，提高大曲原料利用率，還可以豐富大曲及濃香型白酒的風味成分，是重要的吡嗪類化合物合成菌[25-26]；青枯菌屬具有天然的CO2固定能力，能高效的完成從CO2到有機物的生物合成[27]；高溫放線菌屬菌株能夠產(chǎn)生發(fā)達的菌絲體，疏松大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)，維持大曲骨架[28]；Kroppenstedtia多分離自芝麻香型白酒大曲，可能具有產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶的能力[29]；紅球菌屬參與了氨基酸如L-亮氨酸和L-苯丙氨酸的生產(chǎn)以及固醇類的轉(zhuǎn)化[30]；阪崎腸桿菌屬代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物主要有異戊醛、乙醇、異戊醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、正十五烷、正十六烷、正十七烷、1-癸醇，增加風味物質(zhì)[31]；乳酸桿菌為傳統(tǒng)白酒厭氧發(fā)酵重要的功能菌種之一，與濃香型白酒四大酯類之乳酸乙酯的形成具有密切關(guān)系，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長前發(fā)酵期，有利于發(fā)酵有益菌的生長，對于白酒香味物質(zhì)增加有利，同時也是與有機酸相關(guān)性較強的功能細菌[32-33]；此外大曲中的片球菌屬也是釀造體系中廣泛存在的乳酸菌，對于維持釀造過程的食品安全性具有重要意義[34]；魏斯氏菌屬可以將原料中的糖類轉(zhuǎn)化生成乳酸等有機酸，進而與乙醇反應(yīng)生成乙酸乙酯和乳酸乙酯，賦予濃香型白酒濃厚的醇香[35]；葡萄球菌屬在空氣、水、灰塵中均能發(fā)現(xiàn)，因此開放式發(fā)酵的大曲制曲過程中會富集到此類細菌[36]。本實驗中檢測到的菌屬與前人研究結(jié)果一致[37-41]，除上述所報道的菌屬被檢出，還檢出大量其他優(yōu)勢菌屬。此外，相比較而言，川派濃香型白酒大曲主要細菌屬葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬、高溫放線菌屬、乳桿菌屬和Kroppenstedtia，河南濃香型白酒大曲中雖未發(fā)現(xiàn)糖多孢菌屬，但檢出較多的片球菌屬和青枯菌屬類細菌，這可能是因為環(huán)境差異和大曲制作方法的不同。

屬水平細菌屬組成及豐度存在差異，芽孢桿菌屬是YA和YC大曲的絕對優(yōu)勢菌屬，青枯菌屬、乳桿菌屬分別是YB、YD大曲的絕對優(yōu)勢菌屬；高溫放線菌屬僅在YC大曲中占比為20.48%，阪崎腸桿菌僅在YA大曲中占比為12.99%，Microcystis_PCC-7914僅在YB大曲中占比為9.77%；魏斯氏菌屬是YD大曲的絕對優(yōu)勢菌屬占比達16.23%，在YA大曲中占比為1.82%，在YC和YB大曲中豐度較低；片球菌屬和葡萄球菌屬在YA大曲分別占8.43%和1.55%、在YD大曲中分別占2.36%和2.36%；乳桿菌屬在YD大曲中占比（10.57%），高于YA大曲（2.54%）和YB大曲（2.38%）；紅球菌屬在YB、YC和YD大曲中的占比分別為5.52%、3.94%和3.11%；Kroppenstedtia在YC大曲中占比為11.16%高于在YD大曲中的1.41%。四個地區(qū)的大曲樣品中細菌群落組成豐富，不同地區(qū)大曲細菌群落組成雖然有一定相似，但是豐度仍存在差異。

2.4 大曲細菌群落與理化性質(zhì)冗余分析

選擇四個地方大曲理化指標作為環(huán)境因子與大曲中屬水平上細菌豐度前10的微生物進行冗余分析，結(jié)果見圖3，相關(guān)性結(jié)果顯著性檢驗分析見表3。由圖3可知，冗余分析（RDA）前兩個排序軸的累計方差貢獻率為83.63%，其中RDA1為58.84%，RDA2為26.79%；YA大曲和水分相關(guān)性最大，YB大曲和酸度、淀粉含量及液化力相關(guān)性最大，YC大曲和糖化力、液化力及酯化力相關(guān)性最大，YD大曲和酸度、淀粉含量相關(guān)性最大；Bacillus、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Rhodococcus、Ralstonia與糖化力、液化力、酯化力變化呈正相關(guān)，Microcystis_PCC-7914與酸度、淀粉含量、液化力變化呈正相關(guān)，Cronobacter、Pediococcus、Weissella、Lactobacillus與水分和酸度變化呈正相關(guān)。

圖3 大曲樣品細菌群落與理化性質(zhì)冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of bacterial community and physicochemical properties of Daqu samples

表3 大曲樣品細菌群落與理化性質(zhì)相關(guān)性顯著性檢驗Table 3 Significance test of correlation between bacterial community and physicochemical properties of Daqu samples

由表3可知，淀粉含量相關(guān)顯著性檢驗（相關(guān)系數(shù)R2=0.947，P=0.008）對細菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)極顯著，酯化力（相關(guān)系數(shù)R2=0.779，P=0.036）和水分含量（相關(guān)系數(shù)R2=0.566，P=0.047）相關(guān)顯著。結(jié)果表明，大曲的理化性質(zhì)對細菌群落結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性。但不同大曲與不同理化性質(zhì)之間的相關(guān)性有一定差異，這勢必與制曲環(huán)境、氣候等自然條件的差異有關(guān)。

2.5 大曲樣品真菌群落組成分析

由圖4可知，在門水平上，四個大曲樣品中共檢測出3個真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）。子囊菌門相對豐度高且在YA、YB、YC、YD大曲樣品中均為絕對優(yōu)勢真菌門；毛霉門在四種大曲中也屬于優(yōu)勢菌門，在YD、YC、YB大曲中占6.05%～7.90%，在YA大曲中占比較少僅1.06%；擔子菌門在YC大曲中占比最高達10.15%；而YA大曲中擔子菌門僅占0.03%，屬于非優(yōu)勢菌門。子囊菌門、毛霉亞門、擔子菌門是大曲的主要真菌門與之前的報道一致[9，42]。四種樣品之間真菌群落存在著差異，其中YA大曲的真菌多樣性與其他三種大曲差異最大。

圖4 基于門水平的大曲樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungi community structure of Daqu samples at phylum level

由圖5可知，四個樣本中共檢測到8個真菌屬，分別為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、unclassified-o-Eurotiales、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、norank_p_Mucoromycota、Cutaneotrichosporon、畢赤酵母屬（Pichia）、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）、織球殼菌屬（Plectosphaerella）。HUANG Y等[43]借助PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)分析了不同大曲中微生物組成的差異，結(jié)果表明，Saccharomycopsis和Pichia是大曲中主要的酵母屬，與本實驗所得出的酵母屬結(jié)果類似；而有研究表明嗜熱子囊菌屬、根毛霉屬為中高溫酒曲的優(yōu)勢真菌群[44]，本研究與其研究的結(jié)果有一定差異，猜測是由于地區(qū)的差異、制曲工藝不同等因素造成不同大曲間真菌多樣性不同。

圖5 基于屬水平大曲樣品真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungi community structure of Daqu samples at genus level

不同的真菌種類以及占比會賦予大曲各自不同的功能，從而對白酒生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用。有關(guān)研究表明，嗜熱子囊菌屬可以產(chǎn)生多種酶（包括過氧化氫酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等），它在白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的作用不可忽視[44-45]。此外，本實驗中嗜熱子囊菌屬在四種樣品中含量有一定差異，以YA和YD兩種大曲樣品的差異最大，研究表明嗜熱子囊菌屬在大曲中的占比與制曲溫度是有著密切聯(lián)系的。在溫度較高的大曲中此類真菌群落組成單一，其主要原因可能在于其高溫制曲的工藝中，大部分不耐熱的微生物會被除掉，因此會形成以嗜熱或耐熱微生物為主的特殊菌群[46-47]。由此可以發(fā)現(xiàn)制曲工藝中選擇和控制好適宜的溫度會對大曲形成的微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要的作用。未分類的散囊菌目（unclassified-o-Eurotiales）具有重要的新陳代謝作用，可以利用各種底物來生產(chǎn)工業(yè)上重要的產(chǎn)品，如脂質(zhì)、殼聚糖、幾丁質(zhì)、多磷酸鹽、醇和有機酸等[48-49]。復膜孢酵母屬在自然界中存在廣泛，具有分泌α-淀粉酶[50]、蛋白酶在內(nèi)多種水解酶的能力，研究證明該菌屬在發(fā)酵行業(yè)中具有十分重要的作用[4，51]。復膜孢酵母屬不僅具有在窖池中發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力，還可以提高大曲酒中多種醇、酯的含量，從而可以有效的提高原酒品質(zhì)[52]。Cutaneotrichosporon在其他大曲樣品中未檢測到，但此類菌屬具有同化多種糖類和甘油的作用，并且能夠發(fā)酵甘蔗秸稈生產(chǎn)生物乳化劑[53]。畢赤酵母屬在白酒堆發(fā)酵過程中，是耐熱真菌和強大的競爭者，且畢赤酵母屬對于自然發(fā)酵過程中的質(zhì)量控制和管理具有重要意義，可以構(gòu)建白酒發(fā)酵微生物群落[54]。

通過對不同樣品屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，YB、YC、YD三種大曲中嗜熱子囊菌屬為絕對優(yōu)勢真菌屬；YA大曲的絕對優(yōu)勢真菌屬為未分類的散囊菌目（unclassified-o-Eurotiales），而該菌屬在YB、YC大曲中占比較少；復膜孢酵母屬在YB、YC大曲中的含量又遠高于YA、YD大曲；Cutaneotrichosporon在三種大曲中占比大小排序分別為YC＞YB＞YA，在YD大曲中未檢出；畢赤酵母屬在YC、YD中含有一定比例，前者大于后者?？傮w來說，YB、YD大曲的物種豐富度要高于YA和YC大曲，由此可見，原因可能是由于區(qū)域內(nèi)環(huán)境中存在的微生物種類不同而導致，同時也會受到各自大曲制作工藝的控制。

2.6 大曲真菌群落與理化性質(zhì)冗余分析

由圖6可知，RDA前兩個排序軸的累計方差貢獻率為98.65%，其中RDA1為85.19%，RDA2為13.46%；YA大曲和水分相關(guān)性最大，YB大曲糖化力、淀粉含量及液化力相關(guān)性最大，YC大曲和酯化力相關(guān)性最大，YD大曲和酸度相關(guān)性最大；Thermoascus、Malassezia與水分變化呈正相關(guān)，unclassified-o-Eurotiale、norank_p_Mucoromycota、Plectosphaerella與酸度、淀粉含量、液化力、糖化力變化呈正相關(guān)，Saccharomycopsis、Cutaneotrichosporon、Pichia與 酯 化 力、糖化力、淀粉含量、液化力變化呈正相關(guān)。由表4可知，酸度（R2=0.987 9，P=0.012）、酯化力（R2=0.936 4，P=0.033）、水分（R2=0.881 1，P=0.045）對真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)顯著。

圖6 大曲樣品真菌群落與理化性質(zhì)冗余分析結(jié)果Fig.6 Redundant analysis results of fungal community and physicochemical properties of Daqu samples

表4 大曲樣品真菌群落與理化性質(zhì)相關(guān)性顯著性檢驗Table 4 Significance test of correlation between fungal community and physicochemical properties of Daqu samples

3 結(jié)論

該研究采用理化分析結(jié)合高通量測序技術(shù)，分析河南不同地區(qū)濃香型白酒大曲理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)差異；理化性質(zhì)表明，四個不同地區(qū)的大曲在糖化力、酸度和酯化力上存在顯著差異；高通量測序分析表明，從四種大曲中共檢出9個細菌門和28個細菌屬、3個真菌門和8個真菌屬；YA、YC和YD大曲中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，其次為變形菌門，YB大曲則相反；YA和YC大曲的絕對優(yōu)勢菌屬是芽孢桿菌屬，而YB大曲中是青枯菌屬，YD大曲中是乳桿菌屬。不同大曲中子囊菌門和毛霉門占優(yōu)勢，但毛霉門在YA大曲中占比較小；真菌屬水平上，YB、YC、YD大曲中嗜熱子囊菌屬占絕對優(yōu)勢，而YA大曲的絕對優(yōu)勢真菌屬為unclassified-o-Eurotiales。冗余分析表明淀粉含量、酯化力和水分對細菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)（P＜0.05），酸度、酯化力、水分對真菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)（P＜0.05）。