止痛消結(jié)散對小鼠腫瘤細胞與DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)模型TRPV1表達的影響

郭玉玉，胡佳佳，郁沙莎，翟笑楓

（中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海 200083）

癌痛（癌性疼痛）特指由腫瘤直接浸潤神經(jīng)根、神經(jīng)干、神經(jīng)叢或者神經(jīng)，累及空腔及實質(zhì)器官，誘發(fā)局部壞死、炎癥等，引起疼痛，常伴有牽涉痛，對惡性腫瘤患者的生活和生存質(zhì)量產(chǎn)生了嚴重的影響，為目前發(fā)生率最高和最難耐受的臨床癥狀之一，同時也是治療惡性腫瘤的重要組成部分。目前，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將癌痛全面納入癌癥綜合規(guī)劃治療內(nèi)容之中[1]。

背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元是靠近椎間孔內(nèi)側(cè)的脊髓背根腫脹結(jié)節(jié)，接收來自身體受體的所有神經(jīng)沖動，包括疼痛。目前的研究[2]表明，與疼痛傳遞密切相關(guān)的膜通道辣椒素受體1，也稱為TRPV1受體（TRPV1），是一種對Ca+具有高度親和力的非選擇性陽離子通道，它在多感覺傷害感受器中表達，并介導多種急性和持續(xù)性疼痛，如外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疼痛和癌癥疼痛，在調(diào)節(jié)疼痛方面發(fā)揮重要作用。有文獻[3]證明，Lewis肺癌細胞晚期骨轉(zhuǎn)移后，感覺神經(jīng)纖維上TRPV1受體被局部酸性腫瘤微環(huán)境激活，進而誘導骨骼感覺神經(jīng)產(chǎn)生，導致骨痛的發(fā)生。基于此，本研究通過實驗建立腫瘤細胞與DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)模型以及藥物干預模型，探討止痛消結(jié)散的止痛作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞、A549細胞，購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 藥物及主要試劑

止痛消結(jié)散，上海雷允上藥業(yè)有限公司。Trizol（invitrogen）；DEPC處理水（購自Sigma）；氯仿/異丙醇/無水乙醇（購自上海國藥）；SYBRGreen PCR試劑盒（型號Thermo F-415XL）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（型號Thermo K1622）。

1.3 主要儀器

低溫冷凍離心機（型號Sigma 3K15）；Realtime檢測儀（型號ABI-7500）；光學顯微鏡（型號XDS-1A）；電泳儀（購自BIO-RAD 公司，型號mini protean 3 cell）；電轉(zhuǎn)儀（PS-9，大連競邁科技有限公司）；酶標儀（型號ThermoMK3）；一體式化學發(fā)光成像儀（型號ChemiScope 5300 Pro）。

1.4 止痛消結(jié)散浸提液制備

稱取1 g止痛消結(jié)散粉末于50 mL離心管，加入15 mL DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于水浴鍋37 ℃溶解5 h，取上清，用過濾器過濾待用。

1.5 腫瘤細胞與DRG神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)模型建立及分組

1）制備神經(jīng)元細胞懸液：消化收集神經(jīng)元細胞，調(diào)整神經(jīng)元細胞濃度至106/mL，6孔板中接種106/孔；2）腫瘤細胞共培養(yǎng)：制備A549細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為106/mL，在神經(jīng)元細胞培養(yǎng)孔中加入0.4 μm的transwell小室，上室接種腫瘤細胞2×105/孔；3）止痛消結(jié)散處理：共培養(yǎng)模型更換新鮮含1/10止痛消結(jié)散浸提液的完全培養(yǎng)基，下室2 mL，上室500 μL，培養(yǎng)24 h或48 h后收集細胞或上清液進行各指標檢測。實驗分組：1）A組，DRG神經(jīng)元；2）B組，腫瘤細胞+DRG神經(jīng)元組（24 h）（DRG下室，腫瘤細胞上室）；3）C組，腫瘤細胞+DRG神經(jīng)元組（48 h）；4）D組，腫瘤細胞+DRG神經(jīng)元組+止痛消結(jié)散（24 h）；5）E組，腫瘤細胞+DRG神經(jīng)元組+止痛消結(jié)散（48 h）。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測上清液中IL-6的表達情況

共培養(yǎng)模型更換新鮮含1/10止痛消結(jié)散浸提液的完全培養(yǎng)基，下室2 mL，上室500 μL，培養(yǎng)24 h或48 h后收集48孔板各組上清液至無菌離心管中，標記組，取出6孔板中的原培養(yǎng)基，用PBS清洗1次；加入1 mL胰蛋白酶消化至大部分細胞變圓，加入完整培養(yǎng)基終止消化，以1 200 rpm離心3 min收集細胞；用PBS清洗2次。檢測收集的細胞上清液中IL-6的含量，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 Western Blot法檢測共培養(yǎng)體系相關(guān)蛋白表達情況

加入PMSF的預冷Ripa裂解液至樣品中，充分裂解12 000 g，離心10 min，取上清液，定量蛋白質(zhì)并將其儲存在-80℃冰箱中。蛋白質(zhì)樣品電泳和膜轉(zhuǎn)移；BSA在室溫下封閉1 h或4℃過夜。一抗在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。二級抗體與膜在37 ℃孵育1 h，用TBST洗滌3次，每次5 min。在膠片上加入適量的ECL發(fā)光溶液，用集成化學發(fā)光儀拍照。

1.8 實時定量法檢測共培養(yǎng)體系相關(guān)基因的表達情況

收集細胞，用3 mL PBS洗滌細胞2次，棄上清液；加入1 mL Trizol試劑，給予充分均質(zhì)，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動15 s，靜置3 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液；加入0.5 mL異丙醇，充分混合，在冰上放置20～30 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液；添加1 mL 75%乙醇并清洗沉淀物。在4℃下離心7 500 g，持續(xù)5 min，并棄上清液；在超凈臺中吹干約5 min，并添加適量的無核糖核酸酶H2O溶解。提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用RT-PCR檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。測量數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s ）表示。單因素方差分析用于多組之間的比較。2組間采用最小顯著性差異法（LSD法）進行比較。以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 止痛消結(jié)散浸提液對IL-6表達的影響

見表1。

表1 止痛消結(jié)散浸提液對IL-6含量的影響（±s，n = 6）

表1 止痛消結(jié)散浸提液對IL-6含量的影響（±s，n = 6）

注：與A組比較，## P＜0.01；與B組比較，△△P＜0.01；與C組比較，▲▲P＜0.01；與D組比較，□□P＜0.01

組別 含量 /（pg·mL-1）A組 0.000±0.000 B組126.671±9.521##C 組157.899±7.486##△△D 組 65.454±2.900##△△▲▲E 組 32.336±1.825##△△▲▲□□

2.2 止痛消結(jié)散浸提液對TRPV1蛋白表達的影響

與A組相比，與腫瘤細胞共培養(yǎng)24 h和48 h后，目的蛋白TRPV1的表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而在共培養(yǎng)體系中（24 h和48 h）分別加入止痛消結(jié)散處理后，目的蛋白TRPV1表達水平相比共培養(yǎng)組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，止痛消結(jié)散浸提液能降低DRG神經(jīng)元細胞中TRPV1蛋白表達水平。見圖1。

圖1 止痛消結(jié)散浸提液對DRG神經(jīng)元細胞中TRPV1蛋白表達水平的影響

2.3 止痛消結(jié)散浸提液對I L-6 R、Trpv1mRNA表達的影響

Trpv1和IL-6R的變化情況類似，即相比A組，腫瘤細胞與DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)組（24 h，48 h），兩者表達水平顯著增加，其中共培養(yǎng)48 h比24 h顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；加入止痛消結(jié)散處理后，兩者表達水平顯著降低，其中共培養(yǎng)48 h下降程度比共培養(yǎng)24 h顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，止痛消結(jié)散浸提液能降低DRG神經(jīng)元細胞中IL-6R、Trpv1 mRNA表達水平。結(jié)果見圖2。

圖2 止痛消結(jié)散浸提液對DRG神經(jīng)元細胞中IL-6R、TRPV1 mRNA表達水平的影響

3 討論

目前，WHO提出的“癌痛三階梯”規(guī)范治療方案在臨床上應(yīng)用較廣泛，絕大部分患者可有效緩解，但止痛藥使用后不良反應(yīng)較多，易增加成癮性，反復使用易造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生適應(yīng)性變化，對患者的身心健康和社會功能產(chǎn)生了巨大影響[4]。

祖國醫(yī)學通過應(yīng)用辨證論治的理論，對癌痛病人進行辨證施治，提高了止痛藥的效果，并且安全性高，毒副作用較少，不存在成癮性和耐藥性，配合“癌痛三階梯”治療方案可以有效的增效減毒和增強止痛效果[5-6]。其中，中醫(yī)外治法聯(lián)合其他止痛治療方式治療癌痛療效確切、作用迅速、毒副作用小，治療過程安全，有效的提高了癌痛患者的生活質(zhì)量、延長了患者的生存周期。

現(xiàn)代醫(yī)學普遍認為，癌痛的病理產(chǎn)生機制可能與中樞敏化、外周敏化、腫瘤對外周神經(jīng)的直接作用和骨溶解等因素有關(guān)。腫瘤細胞與腫瘤組織周圍存在著大量的不同類型的炎性細胞，例如：中性粒細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和T淋巴細胞，這些炎性細胞可以分泌不同類型的炎性介質(zhì)，包括表皮生長因子、內(nèi)皮素-1、轉(zhuǎn)化生長因子-α、緩激肽、白介素-1、白介素-6、腫瘤壞死因子-α、前列腺素等，這些不同類型的炎性介質(zhì)通過其各自的受體直接或間接作用于初級傳入神經(jīng)元，從而產(chǎn)生疼痛[7]。

在對止痛消結(jié)散中藥物的作用進行文獻分析后，發(fā)現(xiàn)方中的血竭具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，其主要構(gòu)成物質(zhì)中的劍葉龍血素A和劍葉龍血素B等可以有效降低TRPV1的活性[8]。復方血竭可抑制UC大鼠白細胞介素-1β、白細胞介素-6的表達，上調(diào)白細胞介素-4和白細胞介素-10的表達，并且可以調(diào)節(jié)免疫功能異常，從而促進消除炎癥和修復組織[9]。乳香的主要成分乳香酸通過抑制白三烯的合成以及減少5-脂氧合酶的活性從而進一步發(fā)揮抗炎作用[10]。沒藥的主要成分為沒藥油，它能減少IL-6的合成，有效的預防牙周炎和齦炎相關(guān)性炎癥，其機理是能減少成纖維細胞釋放的致炎因子，故常常用于牙齦炎和牙周炎的治療[11]。IL-6是已知參與幾種炎癥和神經(jīng)性痛覺過敏的促炎細胞因子[12-14]。在骨癌痛的大鼠模型中，脊髓中IL-6mRNA水平增加[15]。IL-6通過IL-6R的典型信號傳導或通過IL-6R的反式信號傳導對靶細胞發(fā)揮調(diào)控作用[16]。

本研究觀察到，在腫瘤細胞與DRG神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)模型中加入止痛消結(jié)散浸提液后， IL-6表達水平明顯降低，時間越長，IL-6表達下降越明顯，表明止痛消結(jié)散浸提液能夠抑制IL-6的表達。同時，在共培養(yǎng)體系中加入止痛消結(jié)散浸提液處理后，目的蛋白TRPV1表達水平顯著降低，表明止痛消結(jié)散浸提液能降低DRG神經(jīng)元細胞中TRPV1蛋白表達水平。因此，止痛消結(jié)散能有效的緩解腫瘤患者的癌性疼痛，其作用機制可能與下調(diào)DRG神經(jīng)元中TRPV1表達水平有關(guān)。