HSF1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義*

程麗芳 夏碧霞 何萍秀 吳憶

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是起源于表皮形成細(xì)胞的惡性增殖，大多數(shù)發(fā)生在老年患者的曝光部位，是人類第二常見的癌癥，它的發(fā)病率還在持續(xù)上升[1]。由于其局部侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)老年患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，而老年人特別是高齡老人全身情況較差，難以支持長時(shí)間手術(shù)，因此需要對(duì)cSCC 的分期和預(yù)后做早期診斷并需要除手術(shù)切除之外的多種方法治療[2]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock factor 1，HSF1）是一組普遍存在于真核生物細(xì)胞中調(diào)節(jié)熱休克反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，它的激活與腫瘤的起始、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移廣泛相關(guān)，已被證明是腫瘤啟動(dòng)子和潛在的診斷標(biāo)志物[3]，并與患者的預(yù)后有很強(qiáng)的相關(guān)性[4]。目前有HSF1 和乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥相關(guān)的研究報(bào)道，HSF1 在癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組織，但尚無與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)的研究[5-6]。本研究旨在通過檢測HSF1 在cSCC 中的表達(dá)來探索其與cSCC 分化和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年12 月-2021 年6 月江西省皮膚病專科醫(yī)院病理科確診為cSCC 的42 例患者的癌組織標(biāo)本蠟塊（高中低分化的比例為1∶1∶1，其中有轉(zhuǎn)移性cSCC 8 例），取該患者的癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照；選取3 年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)的10 例cSCC 患者的標(biāo)本蠟塊為復(fù)發(fā)組（高中低分化的比例為5∶4∶1）和隨訪3 年未發(fā)生復(fù)發(fā)的20 例cSCC 患者的標(biāo)本蠟塊為未復(fù)發(fā)組（高中低分化的比例為5∶4∶1）。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國臨床皮膚病學(xué)》。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）資料完整且經(jīng)兩位病理科醫(yī)師雙盲法閱片同時(shí)確診為cSCC；（2）有充足的組織供研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未經(jīng)放療、化療或免疫療法。納入的42 例cSCC 患者中，男21例，女21 例；年齡44～96歲，平均（74.95±11.69）歲；分化程度：高分化14例，中分化14例，低分化14 例。本研究已經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 一抗（兔抗人HSF1 多克隆抗體BA1637）購自武漢博士德生物工程有限公司。二抗（HPR 標(biāo)記鼠/兔通用型二抗）、檸檬酸抗原修復(fù)液購自福州邁新生物科技有限公司。PBS 緩沖液、DAB 顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 采用免疫組化EnVision 法染色 把切成4 μm的石蠟切片脫蠟水洗；滴加3% H2O2內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑作用8 min，PBS 水洗3 次（每次3 min）；檸檬酸修復(fù)液放置高壓鍋中加熱煮沸后取出，將切片置于其中直至冷卻，取出放置孵育盒中，滴加一抗（濃度為1∶400），放置4 ℃冰箱過夜；第二天取出用PBS 水洗3 次（每次3 min）；滴加二抗放置37 ℃水浴箱中孵育16 min，PBS 水洗3 次（每次 3 min）；DAB 顯色，時(shí)間1～3 min；蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染10 s，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗返藍(lán)，脫水（75%酒精、85%酒精、95%酒精，無水酒精水；二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3 各10 s）；中性樹膠封片。光鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 分析HSF1 在cSCC 中的表達(dá)情況。分析HSF1 在cSCC 中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。分析HSF1 在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC組織中的表達(dá)。結(jié)果判讀：HSF1 陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒。由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀。染色強(qiáng)度打分：0 分未著色；1 分淺黃色，略高于背景；2 分棕黃色，明顯高于背景；3 分棕褐色。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～70%為3 分；＞70%為4 分。將以上兩項(xiàng)結(jié)果的乘積分為4 級(jí)：0～2 分為陰性（-）；3、4 分為弱陽性（+）；5～8 分為陽性（++）；9～12 分為強(qiáng)陽性（+++）。其中陰性（-）和弱陽性（+）判定為低表達(dá)即陰性表達(dá)，陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）判定為高表達(dá)即陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行Pearsonχ2檢驗(yàn)和連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSF1 在cSCC 組織中的表達(dá) HSF1 陽性表達(dá)部位主要在細(xì)胞核，見圖1。cSCC 組織HSF1 表達(dá)陽性率為61.90%（26/42），高于對(duì)照組癌旁組織的0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.655，P=0.000），見表1。

表1 HSF1在cSCC組織和癌旁組織表達(dá)[例（%）]

圖1 HSF1在cSCC中的表達(dá)情況

2.2 HSF1 在cSCC 中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、皮損部位的cSCC 患者的HSF1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤最大直徑＞2 cm 患者的HSF1 陽性表達(dá)率高于腫瘤最大直徑≤2 cm 患者（P＜0.05）。不同分化程度cSCC 患者的HSF1 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。發(fā)生轉(zhuǎn)移的cSCC 患者的HSF1陽性表達(dá)率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 HSF1表達(dá)與cSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

2.3 HSF1 在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)的cSCC 患者中的表達(dá) 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC 患者的HSF1 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.017，P=0.897），見表3。

表3 HSF1在復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)cSCC患者中表達(dá)[例（%）]

3 討論

惡性轉(zhuǎn)化伴隨著調(diào)節(jié)發(fā)育、代謝、增殖、運(yùn)動(dòng)及抗壓能力的關(guān)鍵細(xì)胞通路的改變，熱休克因子（HSFs）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，已被證明在所有這些生物過程中發(fā)揮重要作用[7]。癌細(xì)胞長期暴露在各種壓力下，如缺氧和營養(yǎng)缺乏、免疫反應(yīng)、代謝失調(diào)和基因組不穩(wěn)定等，都會(huì)導(dǎo)致HSF1 的激活[8]。HSF1已被證明在許多癌細(xì)胞系、自發(fā)性腫瘤發(fā)生小鼠模型和移植瘤中促進(jìn)癌癥的起始、維持和進(jìn)展[9-10]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，HSF1 在多種腫瘤中過表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-13]。遺傳毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和代謝等各種環(huán)境應(yīng)激原可誘導(dǎo)HSF1 過度激活和升高，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。目前已證實(shí)的HSF1 對(duì)腫瘤的作用及機(jī)制包括：（1）通過提高熱休克蛋白27（HSP27）、熱休克蛋白70（HSP70）和熱休克蛋白90（HSP90）的水平，調(diào)控Bag-3 輔助伴侶分子的表達(dá)和負(fù)調(diào)控促凋亡的X 連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子-1（XAF1）而在腫瘤細(xì)胞逃避程序性細(xì)胞死亡中起重要作用；（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和有絲分裂；（3）與細(xì)胞分裂周期蛋白20（CDC20）結(jié)合及阻斷CDC20 和細(xì)胞分裂周期蛋白27（CDC27）的相互作用來誘導(dǎo)非整倍體形成，而非整倍體常與細(xì)胞分化降低和腫瘤惡性程度增加有關(guān)；（4）癌細(xì)胞中HSF1 水平的升高可以調(diào)節(jié)能量代謝，將葡萄糖利用轉(zhuǎn)向糖酵解途徑，同時(shí)，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，為腫瘤細(xì)胞的快速生長提供能量[15]；（5）調(diào)控和定義腫瘤起始細(xì)胞的表型；（6）改變局部組織環(huán)境以支持腫瘤發(fā)生，包括血管生成、侵襲或間質(zhì)激活；（7）HSF1 作為不同信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如HuR-HIF-1、Slug、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）、PI3K-AKT-mTOR、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路[9]；（8）通過HSP 介導(dǎo)的下游效應(yīng)或其他新的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；（9）促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥[16-17]；（10）HSF1 也以基因組的各種非編碼區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)，HSF1 直接結(jié)合的非編碼基因組位點(diǎn)，包括中心外衛(wèi)星DNA 重復(fù)序列、（亞）端粒DNA 重復(fù)序列、短間雜核元件重復(fù)序列、轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)子等[18]。

HSF1 的激活受細(xì)胞內(nèi)多種分子和信號(hào)通路的調(diào)控，HSF1 的激活和衰減構(gòu)成了一個(gè)維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)定的復(fù)雜循環(huán)，至少包括以下六個(gè)步驟：去抑制、三聚體化、核易位、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活和調(diào)節(jié)HSF1 的穩(wěn)定性。大多數(shù)調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平，包括磷酸化、乙酰化、類泛素化和泛素化。除了轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控外，HSF1 還可被上游轉(zhuǎn)錄因子核呼吸因子2（nuclearrespiratoty factor 2，NRF2）、轉(zhuǎn)錄因子Ying-Yang1（YY1）和轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）上調(diào)。致癌基因Notch1 能夠劫持細(xì)胞的應(yīng)激系統(tǒng)，引發(fā)HSF1 的表達(dá)。MiR-644a 可通過調(diào)節(jié)HSF1 mRNA的穩(wěn)定性下調(diào)HSF1 的表達(dá)[19]。

由于HSF1 的高表達(dá)與疾病的惡化相關(guān)，且HSF1 在腫瘤的起始、促進(jìn)和進(jìn)展中的作用。HSF1可能成為人類癌癥的潛在治療靶點(diǎn)及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，同時(shí)用來評(píng)估癌癥患者的預(yù)后。一些臨床前研究揭示了小分子HSF1 抑制劑的抗腫瘤活性[20]。同時(shí)，HSF1 基因消融在正常細(xì)胞和動(dòng)物基礎(chǔ)生理?xiàng)l件下具有良好的耐受性。HSF1 對(duì)正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞依賴性的差異可以作為一種有效的癌癥治療策略。盡管目前可用的熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）抑制劑缺乏特異性，但對(duì)HSF1 調(diào)控不斷加深了解，加上藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)展，將有助于開發(fā)更有效和更特異的HSF1 抑制劑。隨著對(duì)HSF1 活化和衰減復(fù)雜機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷擴(kuò)大及新技術(shù)的發(fā)展，更特異的靶向、更強(qiáng)效和更有選擇性的HSF1 抑制劑可能在未來幾年被開發(fā)出來[21]。

影響cSCC 預(yù)后的因素眾多[22]，本試驗(yàn)探討了HSF1 在cSCC 中的表達(dá)，與臨床病理特征的關(guān)系及和cSCC 術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，提示HSF1 的陽性表達(dá)與cSCC 的腫瘤最大直徑、分化程度、侵襲性轉(zhuǎn)移相關(guān)，推斷其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用，可為cSCC 的診療提供理論參考，為腫瘤的預(yù)后提供證據(jù)。HSF1 表達(dá)與腫瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性，腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)原因復(fù)雜。

同時(shí)，因HSF1 是cSCC 發(fā)展的重要參與者，本研究下一步將增加樣本量并進(jìn)行分子機(jī)制的探討和研究，為cSCC 相關(guān)靶向藥物的研發(fā)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為老年cSCC 患者的治療提供更多選擇。