枇杷植株對(duì)木霉P3.9菌株及枇杷根腐病病菌的激素響應(yīng)

魯海菊， 朱海燕， 熊欣燕， 張曉永， 謝 昆

(1.紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，云南蒙自 661199； 2.南寧漢和生物科技股份有限公司，廣西南寧 530000)

枇杷(Eriobotryajaponica)為云南省蒙自市特色經(jīng)濟(jì)水果之一，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的重要途徑。近年來，土傳真菌性病害枇杷根腐病在云南省蒙自市普遍嚴(yán)重發(fā)生[1]，每年帶來近千萬元的經(jīng)濟(jì)損失。在農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑對(duì)當(dāng)?shù)罔凌烁『刂菩Ч焕硐氲那闆r下，生物防治有望成為一種綠色有效的控制方法。魯海菊等從枇杷主干韌皮部分離獲得1株內(nèi)生木霉(Trichodermaatroviride)P3.9，已被證實(shí)能成功抑制枇杷根腐病病菌[2]，對(duì)枇杷根腐病有良好的盆栽防效，并對(duì)枇杷植株無不良影響，此外，它還兼具抗菌譜廣[3]，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單[4-5]，能成功定殖于枇杷根際[6]及其植株內(nèi)[7]，能抑制枇杷根際土壤真菌[8]、細(xì)菌[9]及枇杷內(nèi)生真菌[10]等特點(diǎn)，具有重要的開發(fā)利用價(jià)值。研究已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)枇杷植株具有誘導(dǎo)抗性(待發(fā)表)，然而，對(duì)其誘導(dǎo)枇杷植株產(chǎn)生抗病性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未明確。

水楊酸(salicylic acid，簡(jiǎn)稱SA)和茉莉酸(jasmonic acid，簡(jiǎn)稱JA)是與植物防御體系相關(guān)的內(nèi)源信號(hào)物質(zhì)，是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的重要信號(hào)分子[11]。兩者均能啟動(dòng)植物體內(nèi)抗病防御基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物抗病反應(yīng)。水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物系統(tǒng)獲得性抗病過程中起關(guān)鍵作用，病程相關(guān)蛋白積累與植物系統(tǒng)獲得性抗性密切相關(guān)，水楊酸可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)[12]，從而增強(qiáng)植物的系統(tǒng)抗性。水楊酸參與植物抗病原真菌[13]、病毒[14]和細(xì)菌[15]獲得系統(tǒng)抗性，具有廣譜性。研究發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒(TMV)侵染黃瓜植株后，其體內(nèi)水楊酸濃度大幅增加，系統(tǒng)獲得性抗性達(dá)到最大值[16]。水楊酸合成還與蘋果輪紋病[17]、紫楠炭疽病[18]、葡萄霜霉病[19]、芒果采后病害[20]等抗性有關(guān)。茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與激發(fā)植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性[21]。研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸不同調(diào)控通路與香蕉葉斑病[22]、小麥白粉病[23]、稻瘟病[24]、棉花黃萎病[25]、苜蓿黑莖病[26]、油菜菌核病[27]、馬鈴薯晚疫病[28]等植物抗病性有關(guān)。茉莉酸合成還與植物叢枝菌根的形成[29]有關(guān)。因此，為揭示內(nèi)生木霉P3.9菌株誘導(dǎo)枇杷植株抗根腐病病菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究從水楊酸和茉莉酸視角，采用高效液相色譜法研究枇杷根系接種木霉生防菌P3.9菌株及枇杷根腐病病菌后，枇杷體內(nèi)與植物病害防御相關(guān)激素含量的變化規(guī)律，以期為今后枇杷抗性基因的挖掘及內(nèi)生木霉P3.9菌劑的系統(tǒng)開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試枇杷及菌株 枇杷苗為大五星品種，由蒙自市十里鋪枇杷育苗基地提供。內(nèi)生木霉P3.9菌株(T.atroviride)、枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsismicrospora)P3.1、P3.5和P3.6菌株保存于紅河學(xué)院植物病理學(xué)標(biāo)本室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、17 g葡萄糖、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水，pH值為7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn) 于2019年4月9日至6月25日在紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室和蘇州科銘生物科技有限公司完成木霉菌劑發(fā)酵及激素含量測(cè)定；于2019年4月16日前往云南蒙自枇杷育苗基地購(gòu)買大五星枇杷嫁接苗并移栽至營(yíng)養(yǎng)袋，置于紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。

1.2.2 菌種的擴(kuò)繁 將木霉P3.9、枇杷根腐病病菌P3.1、P3.5及P3.6菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，等到平板上長(zhǎng)出孢子后即可取出備用。

1.2.3 木霉菌劑的制備 分別稱量10.0 g米糠、0.2 g果糖、7.0 mL自來水，混勻放入同一個(gè)組培瓶，并以同樣的方法準(zhǔn)備組培瓶60個(gè)。上述稱量好的組培瓶以及250 mL自來水，2個(gè)小燒杯(量程為 100 mL)和幾只量程為1、5 mL的注射器采用高壓蒸汽滅菌法，滅完菌冷卻備用。將培養(yǎng)基上的木霉孢子用蒸餾水洗到小燒杯中，稀釋調(diào)節(jié)孢子濃度為107個(gè)/mL，取1 mL接種到上述組培瓶中，置于 28 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，視木霉生長(zhǎng)情況而定。木霉孢子濃度達(dá)106個(gè)/g備用。

1.2.4 枇杷苗種植及菌劑接種方法 枇杷嫁接苗種植于營(yíng)養(yǎng)袋(23 cm×18 cm)中，枇杷基地自然土壤未經(jīng)消毒，陸地盆栽，苗齡為1年時(shí)做接種試驗(yàn)。用上述木霉菌劑拌土施入根部20 g/株，病原菌菌株用5 mm打孔器打成圓片，用等直徑的打孔器打去枇杷苗根莖韌皮部，將菌片正面貼合木質(zhì)部接種，保鮮膜纏繞保濕，每株接種3個(gè)菌片。處理組1：接種枇杷根腐病病菌P3.1+內(nèi)生木霉P3.9菌劑，處理組2：接種枇杷根腐病菌P3.5+內(nèi)生木霉P3.9菌劑，處理組3：接種枇杷根腐病病菌P3.6+內(nèi)生木霉P3.9菌劑，處理組5：接種內(nèi)生木霉P3.9菌劑，以施入等量米糠和接PDA圓片為處理組4(對(duì)照)，設(shè)10次重復(fù)，常規(guī)肥水管理。接種6 d后分別取對(duì)照組和處理組的枇杷根、莖和葉，取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用液氮冷凍處理后，在-20 ℃的冰箱中保存，干冰送檢。

1.2.5 激素含量檢測(cè) 將上述45個(gè)樣品用干冰寄送至蘇州科銘生物科技有限公司，用高效液相色譜法分別檢測(cè)茉莉酸、游離水楊酸、結(jié)合水楊酸含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用SPSS 19.0軟件，采用Duncan’s多重比較法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷根系JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷根系JA和SA含量的影響情況如表1所示。經(jīng)Duncan’s多重比較，發(fā)現(xiàn)處理組1、2、5 JA含量與對(duì)照組4差異極顯著，處理組3與對(duì)照組4差異不顯著。處理組1、2、5和對(duì)照組4的JA含量分別為 0.239 4、0.211 7、0.483 2、0.331 5 μg/g FW，處理組3的JA含量為0.329 9 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系JA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作，前兩者導(dǎo)致枇杷根系JA含量下降，后者不受影響。處理組1、2、3、5的游離SA含量和對(duì)照組4差異極顯著，且均高于對(duì)照組4，分別為154.06、128.20、337.67、74.26 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系游離SA含量增加，分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到增效作用，其中，與病原菌P3.6互作增效作用最強(qiáng)，與病原菌P3.5互作增效作用最弱，與病原菌P3.1互作增效作用居中。處理組1、2、3、5結(jié)合SA含量和對(duì)照組4差異極顯著，分別為235.00、1 145.60、780.63、1 236.44 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系結(jié)合SA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作增幅消弱，其中，與病原菌P3.5互作降幅最低，與病原菌P3.1互作降幅最高，與病原菌P3.6互作降幅居中。綜上，木霉P3.9菌株通過增加枇杷根系JA和SA含量，提前調(diào)度寄主防御系統(tǒng)，抵抗病原菌的攻擊。

表1 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷根系JA和SA含量的影響

2.2 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷莖部JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷莖部JA和SA含量的影響情況如表2所示。經(jīng)Duncan’s多重比較，發(fā)現(xiàn)處理組1、2、3、5 JA含量和對(duì)照組4差異極顯著，且含量明顯增加，分別為0.683 1、1.591 6、1.032 2、1.199 2 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷莖部JA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作導(dǎo)致JA含量增幅發(fā)生變化。其中，與病原菌P3.5互作的增幅大于與病原菌P3.1互作，與病原菌P3.6互作差異不顯著。處理組1、2、3、5 游離SA含量和對(duì)照組4差異極顯著，且含量極顯著增加，分別為873.56、273.25、534.23、122.91 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷莖部游離SA含量增加。其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到協(xié)同增效作用，其中，與病原菌P3.1互作增效作用最強(qiáng)，與病原菌P3.5互作增效作用最弱，與病原菌P3.6互作增效作用居中。處理組1、2、3、5結(jié)合SA含量與對(duì)照組4差異極顯著，且含量增加，分別為614.20、1 272.41、1 535.76、831.28 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促進(jìn)枇杷莖部結(jié)合SA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到協(xié)同增效作用，其中，與病原菌P3.6互作增幅最大，與病原菌P3.1互作增效作用最弱，與病原菌P3.5互作增效作用居中。綜上，木霉P3.9菌株可以通過增加枇杷莖部JA和SA含量，提前調(diào)度寄主防御系統(tǒng)，抵抗病原菌的攻擊。

表2 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷莖部JA和SA含量的影響

2.3 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷葉部JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷葉部JA和SA含量的影響情況如表3所示。經(jīng)Duncan’s多重比較，發(fā)現(xiàn)處理組1、3 JA含量與對(duì)照組4差異極顯著，且含量增加，處理組2、5與對(duì)照組4差異不顯著。處理組1、3、4葉部茉莉酸含量分別為0.267 1、0.164 9、0.129 1 μg/g FW，處理組2、5葉部茉莉酸含量分別為0.120 5、0.113 7 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病菌P3.1、P3.6及P3.5互作，前兩者可以促使葉部JA含量增加，后者不產(chǎn)生影響。處理組1、3、5游離SA含量與對(duì)照組4差異極顯著，且含量增加，處理組2與對(duì)照組4差異不顯著。處理組1、3、5、4的游離SA含量分別為396.75、508.61、117.16、177.18 ng/g FW，處理組2為184.71 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷葉部游離SA含量降低，其與病原菌P3.1、P3.6和P3.5互作后游離SA含量變化不一致，前兩者增加，后者不變。處理組1、2、3、5結(jié)合SA含量和對(duì)照組4差異極顯著，分別為 1 214.31、828.88、2 541.27、1 206.62 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌P3.1、P3.6及P3.5互作，結(jié)合SA含量變化不一致，前兩者增加，后者降低。綜上，木霉P3.9菌株對(duì)枇杷葉部JA和SA含量影響較復(fù)雜，其中，游離SA含量降低，結(jié)合SA含量升高，JA含量不變。其分別與病原菌P3.1、P3.6和P3.5互作，前兩者JA和SA含量均增加，抵抗病原菌攻擊；后者結(jié)合SA含量降低，JA和游離SA含量不變，導(dǎo)致嚴(yán)重落葉。

表3 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對(duì)枇杷葉部JA和SA含量的影響

3 討論

木霉P3.9菌株與枇杷互作，枇杷根莖JA、游離SA和結(jié)合SA含量均增加。說明木霉P3.9菌株促使枇杷根莖SA和JA含量增加，提前激活枇杷植株防御系統(tǒng)，抵御病原菌的攻擊，對(duì)枇杷根莖有誘導(dǎo)抗性作用。此結(jié)論與木霉對(duì)水稻[30]、黃瓜[31-32]和大豆[33]具有誘導(dǎo)抗性的研究結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，青霉素滅活菌絲體能使煙草SA和JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志基因表達(dá)量上調(diào)，獲得抗TMV病毒的系統(tǒng)獲得性抗性[34]，木霉P3.9菌株促使枇杷根部過氧化物酶(POD)活性增加(待發(fā)表)，由此推測(cè)木霉P3.9菌株誘導(dǎo)的枇杷根部SA的積累與POD基因的表達(dá)呈正相關(guān)。外施SA可以防治冬瓜枯萎病[35]，枇杷根系可通過添加木霉P3.9菌劑誘導(dǎo)SA含量增加，最終達(dá)到防治枇杷根腐病的目的，與植物誘抗劑達(dá)到異曲同工之效。植物自身具有免疫系統(tǒng)，木霉菌作為植物免疫誘導(dǎo)菌[36]之一，具有重要的開發(fā)應(yīng)用前景。

木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌互作，枇杷根部游離SA含量增加，莖部JA、游離SA和結(jié)合SA含量同時(shí)增加。說明枇杷植株被枇杷根腐病病菌攻擊時(shí)，木霉P3.9菌株誘導(dǎo)的枇杷根莖部抗根腐病病菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在差異，根部主要通過增加游離SA含量來啟動(dòng)枇杷防御系統(tǒng)，莖部由JA和SA共同啟動(dòng)其防御系統(tǒng)。SA和JA分別參與活體營(yíng)養(yǎng)和死體營(yíng)養(yǎng)病原菌誘導(dǎo)的抗病過程[37]，而枇杷根部主要通過SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)獲得性抗性功能，由此推測(cè)枇杷根腐病病菌為活體營(yíng)養(yǎng)型。木霉P3.9菌株與病原菌P3.5互作，葉部游離SA和JA含量均不受影響。木霉P3.9菌株分別與病原菌P3.1和P3.6互作，葉部游離SA和JA含量均增加，其中，游離SA增幅前者小于后者。葉部結(jié)合SA含量與游離SA含量變化一致。木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病病菌P3.1、P3.6和P3.5互作，枇杷根系中游離SA含量增幅不一致，其中，與P3.6互作增幅最大，與P3.5互作增幅最小，與P3.1互作增幅居中。游離SA含量增幅越大致病性越強(qiáng)，說明3株枇杷根腐病病菌致病性存在差異。由此推測(cè)枇杷根腐病病菌P3.6菌株的致病性最強(qiáng)，P3.5菌株的致病性最弱，P3.1菌株居中。木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病病菌P3.1和P3.5互作，枇杷根部游離SA含量增加，JA含量降低。此結(jié)果可能與JA和SA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑經(jīng)常發(fā)生拮抗[38]有關(guān)。木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌互作，同樣促使枇杷根部POD和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性增加(待發(fā)表)，由此推斷以上2種防御酶活性增加與枇杷根部游離SA含量增加相關(guān)。此結(jié)果與菊花抗白銹病調(diào)控機(jī)制相似[39]。

SA生物合成途徑及其受體和轉(zhuǎn)錄因子因不同植物各異[40-41]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控各種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而SA轉(zhuǎn)導(dǎo)最關(guān)鍵的因子是NPR1[37]。JAZ蛋白是JA信號(hào)負(fù)調(diào)控因子，其基因家族成員對(duì)病原真菌響應(yīng)模式各不相同[42]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，木豆中存在激素響應(yīng)基因家族JAZ[21]，其中，木豆葉片被真菌侵染后，CcJAZ19基因表達(dá)量顯著增加。病原真菌侵染誘導(dǎo)植物抗性的分子調(diào)控機(jī)制研究不斷深入，已明確草莓抗白粉菌[43]、大麥抗赤霉菌[13]等分子調(diào)控機(jī)制。枇杷抗根腐病病菌分子調(diào)控機(jī)制也值得我們?nèi)ド钊胙芯俊?/p>