水稻紋枯病離體接種鑒定技術(shù)因子量化試驗(yàn)

馬軍韜， 張國民， 鄧凌韋， 王永力， 高洪儒， 王南博， 肖明綱， 趙北平， 任 洋， 宮秀杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，黑龍江哈爾濱 150028； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，黑龍江哈爾濱 150028)

黑龍江省是北方水稻生產(chǎn)大省，是國家糧食安全的“壓艙石”和口糧基地，國計(jì)民生意義重大。水稻紋枯病是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的一種世界性水稻病害，也是黑龍江省水稻生產(chǎn)中的主要病害之一，每年必發(fā)，常年減產(chǎn)5.00%～10.00%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50.00%[1-2]。水稻紋枯病屬于典型的土傳病害[3-4]，在東北主要以菌核為初侵染源，侵染水稻后也主要危害植株的中下部。噴灑化學(xué)藥劑是生產(chǎn)中的主要防治措施，由于藥劑較難到達(dá)靶標(biāo)，防控效果經(jīng)常不佳，反而污染環(huán)境、增加成本[5]。秋季深翻和灌水、春季打撈菌核等農(nóng)業(yè)措施也對病害防控有一定的作用，但受人力缺乏、限時(shí)給水等條件限制，經(jīng)常難以完成[6]。選用抗性品種可以在一定程度上減輕病害的威脅，且操作輕簡，關(guān)注度越來越高。雖然水稻對紋枯病的抗性屬于數(shù)量性狀，缺乏免疫或高抗的品種[7]，但中抗水平的品種還是占有一定比例，只需要通過科學(xué)的方式將其篩選出來，也可在生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。因此，通過何種方式對水稻品種的紋枯病抗性進(jìn)行準(zhǔn)確、快捷的鑒定便成為一項(xiàng)重要工作。

關(guān)于水稻品種的紋枯病抗性鑒定方法很多，常用的是通過田間自然感病的方式進(jìn)行鑒定，如王道澤等均進(jìn)行過相關(guān)研究[8-10]。這種方式雖操作輕簡，但耗時(shí)過長，結(jié)果易受當(dāng)?shù)鼐?、氣候條件的影響，可重復(fù)性較差。相對而言，通過接種方式進(jìn)行品種抗性鑒定，其結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性均要好一些，可重復(fù)性也較好。接種鑒定的方法也很多，主要分為兩大類，第1類為田間條件下的接種鑒定，如撒施法[11]、捆扎法[12]、注射法[13]、嵌入法[14]、外貼法[15]等，以成株期鑒定為主。王子斌等應(yīng)用牙簽嵌入法，以紋枯病RH-9為接種體，對Lemont、武育粳3號、特青、Jasmine 85和YSBR1等5份水稻品種的紋枯病抗性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，其病級均值分別為6.96、6.54、5.59、4.96、2.42，均彼此差異極顯著[16]。王愛民等應(yīng)用牙簽嵌入法，對江蘇省101份水稻品種的紋枯病抗性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，供試水稻抗性總體偏差，抗病品種3份，占比2.97%；中抗品種6份，占比5.94%，其他均為中感以上品種[17]。羅霄鳳等應(yīng)用撒施法，以紋枯病PJ-10為接種體，對四川省187份水稻品種的紋枯病抗性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，12.30%的品種平均病級介于5.1～6.0，72.70%的品種平均病級介于6.1～7.0，發(fā)病較重[18]。田間條件下的各類接種鑒定，嵌入法應(yīng)用較為廣泛，其結(jié)果的認(rèn)可度也較高。第2類為受控條件下的接種鑒定，依據(jù)接種環(huán)境的不同主要分為溫室法鑒定[19]、微室法鑒定[20]、霧室法鑒定[21]等，以苗期鑒定[22]為主。依據(jù)接種植株的不同，又可分為活體鑒定[23]、離體鑒定[24]等。Nelson等利用“霧室接種法”與“微室接種法”接種鑒定197個(gè)DH系，通過111個(gè)SSR標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)4個(gè)抗性QTLs來自抗病親本MCR10277，總共可解釋47%遺傳變異；最大效應(yīng)的QTL命名為qsbr_9.1[25]。郭田等利用“霧室接種法”接種紋枯病菌株GD-118，在此基礎(chǔ)上完成PS04菌株對水稻紋枯病的防效分析，發(fā)現(xiàn)PS04菌株發(fā)酵液對水稻苗期紋枯病兼具保護(hù)性和治療性，其防效分別達(dá)93.65%、92.02%[26]。關(guān)于離體葉片接種鑒定技術(shù)，研究和應(yīng)用的學(xué)者相對偏少[27-29]，對各技術(shù)因子進(jìn)行量化分析和比較的更少。馬晨燕等對水稻紋枯病離體葉片接種方法進(jìn)行了改進(jìn)，對接種條件進(jìn)行了更精確的控制，量化了病情調(diào)查方法，結(jié)果顯示抗病品種和感病品種相對病斑面積差異顯著，與大田接種及苗期“微室”接種結(jié)果一致[30]。

上述各類鑒定技術(shù)互有優(yōu)勢，也各有局限性。本研究力圖通過相關(guān)技術(shù)因子的量化分析，改進(jìn)離體葉片接種鑒定技術(shù)，在發(fā)揮其輕簡、快捷、適宜規(guī)?；b定等優(yōu)勢的同時(shí)，提高其鑒定的準(zhǔn)確性。同時(shí)，本研究還應(yīng)用認(rèn)可度較高的田間嵌入接種鑒定方式對離體葉片接種鑒定結(jié)果進(jìn)行復(fù)評，以確保技術(shù)真實(shí)可信。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻3份，分別為五優(yōu)稻4號、龍稻18、松粳22，均為黑龍江省第一積溫帶推廣品種。

供試紋枯病菌株1份，編號為19-62，為黑龍江省第一積溫帶代表性菌株，致病力中等強(qiáng)度，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

試驗(yàn)時(shí)間為2019年5—9月；試驗(yàn)地點(diǎn)為哈爾濱市道外區(qū)民主鎮(zhèn)，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 離體葉片接種鑒定技術(shù) 在前期定性試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，完成相關(guān)試驗(yàn)因子的定量分析。本試驗(yàn)中應(yīng)用的離體接種鑒定技術(shù)的框架方法為鐵盤內(nèi)平鋪浸濕的雙層面巾紙，選取充分展開的心葉(葉齡為6葉)剪成30 cm葉段，正面朝上放置于面巾紙上，將直徑6 mm的紋枯病菌絲塊接種在葉片正面的中間部位，噴水保持微環(huán)境相對濕度85%左右，封口膜密封，于28 ℃，光照14 h/黑暗10 h條件下共培養(yǎng)，分別于接種后24、48、72、96、120 h進(jìn)行數(shù)據(jù)調(diào)查。每個(gè)處理接種5個(gè)葉段，3次重復(fù)。

葉片黃化抑制試驗(yàn)，僅接種無菌水，不接種紋枯病菌，在葉段兩端切口處分別加入0.5 mL供試溶液，共設(shè)置0.005 g/mL氯化鈉、0.000 1 g/mL苯并咪唑和清水3個(gè)處理；接種體類型篩選試驗(yàn)，共設(shè)置菌核、菌懸液、菌絲塊3個(gè)處理；葉片長度篩選試驗(yàn)，共設(shè)置5、10、20、30 cm 等4個(gè)處理；葉片層面篩選試驗(yàn)，共設(shè)置葉片正面和葉片背面2個(gè)處理；接種最佳溫度篩選試驗(yàn)，共設(shè)置22、25、28、30 ℃等4個(gè)處理；接種相對濕度篩選試驗(yàn)，共設(shè)置相對濕度65%、75%、85%、95%等4個(gè)處理；接種光照時(shí)間篩選試驗(yàn)，共設(shè)置光照時(shí)間8、10、12、14、16 h等5個(gè)處理。上述所有試驗(yàn)，除自身設(shè)置的處理外，其他具體操作同框架方法。

1.2.2 田間嵌入接種鑒定技術(shù) 將木質(zhì)牙簽剪成0.8～1.0 cm小段，均勻鋪在玻璃培養(yǎng)皿底部，加入PDB液體培養(yǎng)基浸沒牙簽，滅菌后接種新鮮紋枯病菌塊，28 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，待牙簽表面密布菌絲即可用于接種。在水稻分蘗末期，用鑷子將帶菌牙簽嵌入水稻倒3葉葉鞘內(nèi)側(cè)，接種后葉鞘抱莖狀態(tài)基本不變。每個(gè)品種接種10個(gè)主分蘗，3次重復(fù)，接種后田間保持2～5 cm淺水層[31]。

1.2.3 鑒定標(biāo)準(zhǔn) 離體葉片接種鑒定標(biāo)準(zhǔn)[32]，接種后24、48、72、96、120 h進(jìn)行發(fā)病調(diào)查，將5個(gè)接種葉段作為1個(gè)整體調(diào)查病斑面積占比，具體分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，葉片無病斑；1級，0<病斑面積≤12.50%葉片面積；2級，12.50%葉片面積<病斑面積≤25.00%葉片面積；3級，25.00%葉片面積<病斑面積≤50.00%葉片面積；4級，50.00%葉片面積<病斑面積≤75.00%葉片面積；5級，病斑面積>75.00%葉片面積。

田間嵌入接種鑒定標(biāo)準(zhǔn)[33]，水稻黃熟期植株發(fā)病完全后開始調(diào)查，每個(gè)接種的主分蘗均需進(jìn)行調(diào)查，具體分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，全株無病；1級，基部葉片葉鞘發(fā)?。?級，第3葉片以下各葉鞘或葉片發(fā)病(自頂葉算起，下同)；3級，第2葉片以下各葉鞘或葉片發(fā)??；4級，頂葉葉鞘或頂葉發(fā)??；5級，全株枯死。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用DPSv14.10分析軟件，以SNK法進(jìn)行樣本差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片黃化抑制試驗(yàn)

由表1可知，接種后24、48、72 h調(diào)查，氯化鈉、苯并咪唑和清水處理無差別，葉片均未黃化。接種后96 h調(diào)查，清水處理下五優(yōu)稻4號葉片略有黃化，黃化面積約占接種葉片總面積的0.87%，其他處理葉片均未黃化。接種后120 h調(diào)查，清水處理下五優(yōu)稻4號、龍稻18和松粳22葉片黃化均較明顯，黃化面積占比分別為3.66%、2.52%、2.29%；氯化鈉處理下五優(yōu)稻4號、龍稻18和松粳22葉片均略有黃化，黃化面積占比分別為1.25%、0.93%、1.04%；苯并咪唑處理下五優(yōu)稻4號、龍稻18和松粳22葉片均略有黃化，黃化面積占比分別為1.43%、1.22%、1.10%。此外，差異顯著性分析表明，在0.05水平上，接種后120 h清水處理與氯化鈉處理、苯并咪唑處理均差異顯著，氯化鈉處理與苯并咪唑處理差異不顯著，3個(gè)水稻品種結(jié)果一致。綜合對比，氯化鈉對葉片黃化抑制效果最好。

表1 不同處理下水稻品種葉片黃化情況

2.2 最佳調(diào)查時(shí)間試驗(yàn)

由表2可知，接種后24、48 h各水稻品種紋枯病發(fā)病均不夠完全，五優(yōu)稻4號接種后24、48 h的病斑面積占比分別為4.43%、10.35%，只相當(dāng)于接種后72 h病斑面積占比的19.35%、45.22%；龍稻18接種后24、48 h的病斑面積占比分別為3.85%、9.30%，只相當(dāng)于接種后72 h病斑面積占比的21.97%、53.08%；松粳22接種后24、48 h的病斑面積占比分別為3.40%、6.69%，只相當(dāng)于接種后72 h病斑面積占比的24.55%、48.30%；調(diào)查結(jié)果誤差較大，在0.05水平上與接種后72 h均差異顯著，均不是最佳調(diào)查時(shí)間。而接種后72 h各水稻品種紋枯病發(fā)病基本完全，其調(diào)查結(jié)果與接種后96、120 h 調(diào)查結(jié)果差別很小，病斑持續(xù)擴(kuò)展趨勢不明顯，在0.05水平上均差異不顯著，且3個(gè)水稻品種結(jié)果一致。綜合對比，初步認(rèn)為接種后72 h調(diào)查即可。

2.3 接種體類型篩選試驗(yàn)

由表3可知，以菌核為接種體，3個(gè)水稻品種發(fā)病速度均偏慢，接種后72 h逐步發(fā)病且病斑面積占比很低，分別為3.53%、3.06%、2.73%；接種后 120 h 發(fā)病接近完全，病斑面積占比為22.57%、17.57%、14.02%。以菌懸液為接種體，3個(gè)水稻品種發(fā)病均過重，接種后72 h病斑面積占比分別為55.68%、53.91%、52.84%，品種間幾乎無差別，在0.05水平上差異均不顯著，不利于品種的抗性鑒定。以菌絲塊為接種體，3個(gè)水稻品種發(fā)病速度適中，接種后72 h病斑面積占比分別為22.97%、17.79%、13.95%，品種間抗感性差別明顯，在0.05水平上五優(yōu)稻4號與龍稻18、松粳22均差異顯著，適宜抗性鑒定。

表2 不同調(diào)查時(shí)間下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

2.4 葉片長度篩選試驗(yàn)

由表4可知，接種后72 h，3個(gè)水稻品種葉片長度5 cm的處理中，其病斑面積占比介于82.71%～97.35%，占比均很高，病斑極有可能受到葉片長度的限制而沒有擴(kuò)展完全，造成嚴(yán)重誤差甚至錯(cuò)誤，不建議應(yīng)用；葉片長度10 cm的處理中，其病斑面積占比介于41.89%～69.34%，結(jié)果稍好，但占比依然偏高，也不建議應(yīng)用；葉片長度20 cm的處理中，其病斑面積占比介于21.03%～34.26%，基本可以滿足病斑擴(kuò)展的空間需求，但鑒于試驗(yàn)選用菌株致病力強(qiáng)度中等這一前提，也不是最佳選擇；葉片長度30 cm的處理中，其病斑面積占比介于13.78%～22.56%，可以滿足病斑擴(kuò)展的空間需求，初步確定為最佳選擇。此外，接種后72 h，不同葉片長度各處理在0.05水平上均彼此差異顯著，3個(gè)水稻品種結(jié)果一致。

表3 不同接種體接種后水稻品種病斑擴(kuò)展情況

表4 不同葉片長度下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

2.5 葉片層面篩選試驗(yàn)

由表5可知，3個(gè)水稻品種葉片背面接種的處理中，發(fā)病明顯偏慢，接種后48 h內(nèi)均不發(fā)?。唤臃N后72 h逐步發(fā)病且病斑面積占比很低，分別為7.32%、4.33%、3.59%，僅為同期正面接種各處理病斑面積的24.28%～32.09%；接種后120 h病斑擴(kuò)展近完全，其病斑面積占比分別為22.14%、16.69%、14.03%，僅與正面接種72 h各處理的病斑面積占比持平或略低。綜合對比，葉片正面接種試驗(yàn)效果較好。

2.6 接種溫度篩選試驗(yàn)

由表6可知，五優(yōu)稻4號接種后72 h，接種溫度22、25、28、30 ℃各處理病斑面積占比分別為14.76%、18.67%、22.08%、22.55%，接種溫度 30 ℃ 處理病斑面積占比最高，接種溫度28 ℃處理次之，但二者差別很小；接種溫度22 ℃處理病斑面積占比最低，僅為接種溫度30 ℃處理的65.45%，在0.05水平上與其他3個(gè)溫度處理均差異顯著。龍稻18接種后72 h，接種溫度22、25、28、30 ℃各處理病斑面積占比分別為12.74%、14.97%、16.92%、17.04%， 接種溫度30 ℃處理病斑面積占比最高，接種溫度28 ℃處理次之；接種溫度22 ℃處理病斑面積占比最低，僅為接種溫度30 ℃處理的74.77%，在0.05水平上分別與接種溫度28、30 ℃處理差異顯著，與接種溫度25 ℃處理差異不顯著。松粳22接種后72 h，接種溫度22、25、28、30 ℃各處理病斑面積占比分別為9.63%、12.13%、13.87%、13.98%，接種溫度30 ℃處理病斑面積占比最高，接種溫度28 ℃處理次之；接種溫度22 ℃處理病斑面積占比最低，僅為接種溫度30 ℃處理的68.88%，在0.05水平上與接種溫度28、30 ℃處理差異顯著，與接種溫度25 ℃處理差異不顯著。綜合對比，接種溫度30、28 ℃試驗(yàn)效果均較好。

表5 不同葉片層面下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

表6 不同接種溫度下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

2.7 接種相對濕度篩選試驗(yàn)

由表7可知，五優(yōu)稻4號接種后72 h，接種相對濕度65%、75%、85%、95%各處理病斑面積占比分別為3.66%、7.26%、23.07%、14.43%，接種相對濕度85%處理病斑面積占比最高，接種相對濕度95%處理次之；接種相對濕度65%處理病斑面積占比最低，僅為接種相對濕度85%處理的15.86%，在0.05水平上與其他3個(gè)處理均差異顯著。龍稻18接種后72 h，接種相對濕度65%、75%、85%、95%各處理病斑面積占比分別為2.67%、7.13%、17.86%、12.60%，接種相對濕度85%處理病斑面積占比最高，接種相對濕度95%處理次之；接種相對濕度65%處理病斑面積占比最低，僅為接種相對濕度85%處理的14.95%，在0.05水平上與其他3個(gè)處理均差異顯著。松粳22接種后72 h，接種相對濕度65%、75%、85%、95%各處理病斑面積占比分別為2.71%、5.57%、13.91%、9.76%，接種相對濕度85%處理病斑面積占比最高，接種相對濕度95%處理次之；接種相對濕度65%處理病斑面積占比最低，僅為接種相對濕度85%處理的19.48%，在0.05水平上與其他3個(gè)處理均差異顯著。綜合對比，接種相對濕度85%試驗(yàn)效果最好。

2.8 接種光照時(shí)間篩選試驗(yàn)

由表8可知，五優(yōu)稻4號接種后72 h，接種光照時(shí)間8、10、12、14、16 h各處理病斑面積占比分別為21.50%、21.78%、22.66%、22.97%、22.84%，接種光照時(shí)間14 h處理病斑面積占比最高，接種光照時(shí)間16 h處理次之；接種光照時(shí)間8 h處理病斑面積占比最低，為接種光照時(shí)間14 h處理的93.60%，在0.05水平上與其他4個(gè)處理差異均不顯著。龍稻18接種后72 h，接種光照時(shí)間8、10、12、14、16 h各處理病斑面積占比分別為17.19%、17.31%、17.59%、17.83%、17.91%，接種光照時(shí)間16 h處理病斑面積占比最高，接種光照時(shí)間14 h處理次之；接種光照時(shí)間8 h處理病斑面積占比最低，為接種光照時(shí)間16 h處理的95.98%，在0.05水平上與其他4個(gè)處理均差異不顯著。松粳22接種后72 h，接種光照時(shí)間8、10、12、14、16 h各處理病斑面積占比分別為12.85%、13.10%、13.24%、13.52%、13.44%，接種光照時(shí)間14 h處理病斑面積占比最高，接種光照時(shí)間16 h處理次之；接種光照時(shí)間8 h處理病斑面積占比最低，為接種光照時(shí)間14 h處理的95.04%，在0.05水平上與其他4個(gè)處理差異均不顯著。綜合對比，接種光照時(shí)間對試驗(yàn)效果影響偏小，接種光照時(shí)間14 h試驗(yàn)效果最好。

表7 不同接種相對濕度下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

表8 不同接種光照下水稻品種病斑擴(kuò)展情況

2.9 2種鑒定技術(shù)對比試驗(yàn)

綜合前述各技術(shù)因子定量分析結(jié)果，初步認(rèn)為紋枯病離體葉片接種技術(shù)流程如下，選取6葉期充分展開的心葉，長度為30 cm，正面朝上放置于面巾紙上，將直徑6 mm的紋枯病菌絲塊接種在葉片正面的中間部位，不需加入黃化抑制劑，噴水保持微環(huán)境相對濕度85%左右，封口膜密封，于28 ℃，光照14 h/黑暗10 h條件下共培養(yǎng)，72 h后進(jìn)行數(shù)據(jù)調(diào)查。由表9可知，每個(gè)處理接種5個(gè)葉段，3次重復(fù)。在此條件下，五優(yōu)稻4號、龍稻18和松粳22的病斑面積占比平均值分別為22.89%、17.52%、13.85%，在0.05水平上彼此差異顯著。其中，松粳22抗性最好，五優(yōu)稻4號抗性最差。從發(fā)病級別來看，3個(gè)品種都是2級。

表9 接種后72 h離體葉片接種下水稻品種發(fā)病情況

田間嵌入接種鑒定結(jié)果顯示，五優(yōu)稻4號、龍稻18和松粳22的平均發(fā)病級別分別為2.60、2.20、1.90級，在0.05水平上，五優(yōu)稻4號的平均發(fā)病級別與龍稻18、松粳22均差異顯著。其中，松粳22抗性最好，五優(yōu)稻4號抗性最差(表10)。

表10 田間嵌入接種下水稻品種發(fā)病情況

3 討論與結(jié)論

從葉片黃化角度分析，水稻品種間雖有一定差別，但整體趨勢一致，是否添加黃化抑制劑主要取決于設(shè)定的調(diào)查時(shí)間，如果在接種后72 h內(nèi)完成數(shù)據(jù)調(diào)查，則不需添加；如果在接種后120 h以上進(jìn)行調(diào)查，建議添加一定的氯化鈉。此外，本試驗(yàn)是在接種體為無菌水的前提下獲得的結(jié)果，如果接種體變?yōu)榧y枯病菌，受病菌侵染影響，葉片黃化可能會(huì)更嚴(yán)重一些。

從病斑相對擴(kuò)展速度角度分析，在認(rèn)為接種后72 h即發(fā)病完全的前提下，雖然松粳22整體抗性最強(qiáng)，但在侵染前期(接種后24 h以內(nèi))病斑相對擴(kuò)展速度卻最快，即接種后24 h病斑面積占比與接種后72 h病斑面積占比的比值最高，本研究所有試驗(yàn)中最佳處理下的數(shù)據(jù)均表現(xiàn)出這一趨勢；依此原則，在侵染中期(接種后24～48 h)病斑相對擴(kuò)展速度最快的是龍稻18；在侵染后期(接種后48 h以上)病斑相對擴(kuò)展速度最快的是五優(yōu)稻4號。上述情況的出現(xiàn)，可能與品種自身的抗性機(jī)制有一定的關(guān)系，尚需通過各類組學(xué)研究方可得出進(jìn)一步結(jié)論。

從接種體類型角度分析，菌懸液不能有效分辨品種間的抗感性差別，明顯不適用；菌核雖能分辨品種間的抗感性差別，但發(fā)病偏慢，影響試驗(yàn)效率，后期可能出現(xiàn)的葉片黃化也會(huì)對調(diào)查結(jié)果造成一定干擾，易產(chǎn)生誤差，也不是最佳的接種體；菌絲塊接種后發(fā)病速度和發(fā)病效果均較適中，是較為理想的接種體。

從接種葉片層面角度分析，無論葉片正面接種，還是背面接種，均可使紋枯病發(fā)病完全，理論上均可行。但在實(shí)際操作中，葉片背面接種發(fā)病偏慢，試驗(yàn)效率偏低，后期可能出現(xiàn)的葉片黃化也會(huì)對調(diào)查結(jié)果造成一定干擾，易產(chǎn)生誤差，不是最佳選擇。因此，建議葉片正面接種。

從接種溫度角度分析，接種溫度30、28 ℃處理較適宜發(fā)病且二者差別很小，接種溫度22 ℃處理發(fā)病較差，不建議應(yīng)用。此外，依據(jù)病斑面積占比的相對變化，在認(rèn)為接種溫度30 ℃處理發(fā)病完全的前提下，接種溫度22 ℃處理下五優(yōu)稻4號僅發(fā)病65.45%，是3個(gè)水稻品種中最低的，也側(cè)面說明五優(yōu)稻4號對接種溫度的變化可能最為敏感，在一定的溫度范圍內(nèi)，更適宜的接種溫度會(huì)更明顯地加速發(fā)??；同理，龍稻18對接種溫度的變化最不敏感，松粳22居中。

從接種相對濕度角度分析，相對濕度85%各處理發(fā)病更快、發(fā)病效果最好；相對濕度65%各處理發(fā)病最慢，接種后48 h才開始發(fā)病，接種后120 h病斑仍在擴(kuò)展；相對濕度75%各處理發(fā)病情況與之類似，但發(fā)病速度偏快；相對濕度95%各處理菌絲生長速度最快，發(fā)病速度也較快，在接種后96 h發(fā)病趨近完全。接種后72 h調(diào)查，相對濕度85%的平均病斑面積占比分別是相對濕度65%、75%、95%各處理平均病斑面積占比的6.04、2.73、1.48倍。這一結(jié)論與王子斌等的研究結(jié)論[23]一致。此外，依據(jù)病斑面積占比的相對變化，側(cè)面說明龍稻18對接種相對濕度的變化可能最為敏感，松粳22對接種相對濕度的變化最不敏感，五優(yōu)稻4號居中。

從接種光照時(shí)間角度分析，光照時(shí)間各處理差別均較小。接種后72 h調(diào)查，五優(yōu)稻4號和松粳22在光照時(shí)間14 h處理下病斑面積占比最高，3個(gè)水稻品種的平均病斑占比也最高，為18.11%；龍稻18在光照時(shí)間16 h處理下病斑面積占比最高，3個(gè)水稻品種的平均病斑面積占比較高，為18.06%；在光照時(shí)間8 h處理下，3個(gè)水稻品種病斑面積占比均最低，平均病斑面積占比為17.18%，差別同樣較小。

從鑒定技術(shù)角度分析，離體葉片接種鑒定技術(shù)和田間嵌入接種鑒定技術(shù)可以相互印證，試驗(yàn)結(jié)論整體趨勢一致，說明技術(shù)本身沒有太大問題，這一結(jié)論與馬晨燕等的研究結(jié)論[30]一致。但離體葉片鑒定結(jié)果必須結(jié)合病斑面積占比進(jìn)行具體分析，因?yàn)椴∏榉旨墭?biāo)準(zhǔn)劃分不夠精細(xì)，品種間抗性的微小差別難以體現(xiàn)，這就需要在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步細(xì)化分級標(biāo)準(zhǔn)，以使抗性評價(jià)更加科學(xué)、準(zhǔn)確。