綠豆遺傳連鎖圖譜加密及生育期相關(guān)性狀的QTL定位

蔡德寶， 丁冬會(huì)， 馬 樂(lè)， 楊樹(shù)瓊， 孫新穎， 陳吉寶

(南陽(yáng)師范學(xué)院/南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南南陽(yáng) 473061)

綠豆(Vignaradiata)是豆科(Leguminosae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆屬(Vigna)植物中的一個(gè)栽培種，因其相對(duì)耐旱性強(qiáng)、具有固氮作用以及較短的生育期等特性而廣受歡迎，是豆類(lèi)植物中重要的作物[1-2]。生育期是作物高產(chǎn)育種中極為重要的指標(biāo)，它不僅決定了品種的種植地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性，而且與抗逆性、品質(zhì)以及產(chǎn)量密切相關(guān)[3-7]。綠豆屬于短日照作物，其生育期相關(guān)性狀主要包括始花期、開(kāi)花期、始熟期、成熟期等，這些性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，遺傳力高且遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，在分離群體中呈連續(xù)分布，可以通過(guò)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱(chēng)QTL)定位和圖位克隆的方法獲得這些基因[8-10]。

獲得一張高質(zhì)量的遺傳圖譜是基因定位、圖位克隆乃至基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)[11]，在綠豆中，葉衛(wèi)軍等利用RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP 等分子標(biāo)記和F2群體、回交群體、重組自交系群體(recombinant inbreed line，簡(jiǎn)稱(chēng)RIL)等作圖群體構(gòu)建了至少20張遺傳圖譜[12]。在綠豆轉(zhuǎn)綠組和基因組數(shù)據(jù)公布之前，可用的分子標(biāo)記十分有限，前人所繪制的綠豆遺傳連鎖圖譜主要基于栽培綠豆和野生綠豆雜交形成的群體，其主要原因是利用野生綠豆和栽培綠豆的種間雜交更容易篩選到多態(tài)性分子標(biāo)記[13]。Kang等公布的首張綠豆基因組序列草圖和大量SSR分子標(biāo)記[1]，為利用2個(gè)栽培綠豆品種雜交構(gòu)建群體繪制高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜提供前提[13-14]。近年來(lái)，綠豆生育期相關(guān)性狀的QTL定位也取得一定進(jìn)展。梅麗等用RIL群體在廣西壯族自治區(qū)和北京2個(gè)生境下進(jìn)行綠豆生育期相關(guān)性狀的QTL定位[7]，共鑒定出了4個(gè)與開(kāi)花期相關(guān)的基因位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率在4.95%～34.53%之間；共鑒定了4個(gè)成熟期QTL，分布LG2、LG9上。Isemura等發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與初花期緊密相關(guān)的QTL，其中位于LG2上的QTL貢獻(xiàn)率最大[15]。Kajonphol等鑒定了6個(gè)始熟期QTL位點(diǎn)，位于第2、4、6、7、9、11連鎖群上[16]。Somta等在雨季和旱季2種環(huán)境下對(duì)綠豆開(kāi)花期進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到7個(gè)QTL，其中位于LG2A連鎖群上的2個(gè)標(biāo)記區(qū)間在2種環(huán)境下均檢測(cè)到開(kāi)花期QTL[17]。

盡管對(duì)綠豆的生育期相關(guān)性狀已有大量研究，鑒定出了一些生育期相關(guān)QTL位點(diǎn)，但是還存在以下問(wèn)題需要解決：(1)這些研究限于綠豆開(kāi)花期、成熟期等生殖生長(zhǎng)階段，缺乏對(duì)綠豆?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段的研究，更沒(méi)有對(duì)各生育期相關(guān)性狀進(jìn)行系統(tǒng)分析；(2)還有新的生育期相關(guān)性狀位點(diǎn)沒(méi)有完全分離出來(lái)，需要繼續(xù)發(fā)掘；(3)盡管目前研究者繪制了多張綠豆遺傳連鎖圖譜，但由于標(biāo)記數(shù)量少，分辨率低，不能滿(mǎn)足基因圖位克隆的條件。本研究以RIL群體為材料，在自然條件下通過(guò)3年的田間表型評(píng)價(jià)，研究綠豆生育期相關(guān)性狀的遺傳特征，通過(guò)對(duì)Liu等構(gòu)建的圖譜[14]加密，整合1張高密度綠豆遺傳連鎖圖譜，應(yīng)用新圖譜定位綠豆生育期相關(guān)性狀QTL，為綠豆生育期研究提供標(biāo)記信息，推動(dòng)綠豆熟性分子育種的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用綠豆RIL群體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所食用豆課題組提供，該群體以晚熟材料鸚哥綠和早熟材料VC2917為父母本構(gòu)建而成，包含261個(gè)株系[14，18]，目前已經(jīng)繁殖至F9代。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

大田試驗(yàn)于2018—2020年春季在河南省南陽(yáng)師范學(xué)院農(nóng)田進(jìn)行，于每年4月下旬播種，完熟后收獲。綠豆生長(zhǎng)期間按照正常田間管理措施進(jìn)行，于分枝形成前中耕1次，并起壟培土，整個(gè)生長(zhǎng)期間不人為澆水。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。

出苗期(GD)、三葉期(TLD)、分枝期(BS)、始花期(FFD)、始花期-分枝期(FFD-BS)、開(kāi)花期(FD)、開(kāi)花期-分枝期(FD-BS)、成熟期(MD)嚴(yán)格按照《綠豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)[8]。

參照陳吉寶的方法[19]計(jì)算2018、2019、2020年3個(gè)年份8個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)的BLUE值。用SPSS 24.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、方差分析(ANOVA)和相關(guān)性分析，并計(jì)算廣義遺傳率。

1.3 SSR分子標(biāo)記的篩選和基因分型

本研究總計(jì)篩選SSR引物275對(duì)，其中250對(duì)為Kang等開(kāi)發(fā)[1]，下載自NCBI網(wǎng)站綠豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)代碼JJMO00000000)，前綴為“Vr”；25對(duì)為L(zhǎng)iu等從綠豆近源種小豆中篩選[14]，前綴為“CEDG”。

取綠豆RIL群體苗期鮮嫩葉片，用研缽在液氮環(huán)境中研磨成粉狀，綠豆RIL群體單株及親本基因組DNA采用試劑盒(EasyPure? Plant Genomic DNA Kit)提取；PCR擴(kuò)增采用10 μL反應(yīng)體系：酶(2×EasyTaq? PCR SuperMix for PAGE+dye)5 μL，引物0.5 μL (10 μmol/L)，模板1 μL(50 ng/μL)，ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)程序及銀染檢測(cè)參考王建花等的方法[11]。

1.4 遺傳連鎖圖譜的加密

選擇2個(gè)親本間具有明顯多態(tài)性的SSR標(biāo)記進(jìn)行RIL群體的基因分型。讀板時(shí)母本帶型記作“A”，父本帶型記作“B”，雜合帶型記作“H”，空缺或其他帶型記作“X”。利用卡平方測(cè)驗(yàn)分析每個(gè)標(biāo)記在0.05、0.01和0.001水平上是否符合1 ∶1的分離規(guī)律，用于推斷標(biāo)記偏分離情況。

利用QTL IciMaping V4.0軟件[20]加密綠豆遺傳連鎖圖譜，加密前遺傳連鎖圖譜由Liu等構(gòu)建[14]。加密參照軟件提供的Sampledata進(jìn)行數(shù)據(jù)格式化，用Grouping命令對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行分組，比較不同LOD值下的分組情況，選擇最優(yōu)分組；運(yùn)算法則選用“nnTwoOpt”，其他參數(shù)采用軟件默認(rèn)值。

1.5 生育期性狀的QTL分析

本研究基于Liu等構(gòu)建的圖譜[14]，利用加密后的圖譜進(jìn)行QTL定位，采用QTL IciMapping V4.0軟件改進(jìn)復(fù)合區(qū)間作圖法定位[20]，Permutation次數(shù)設(shè)置為1 000次，LOD值以大于等于2.5為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆生育期性狀遺傳分析

從表1可以看出，RIL群體內(nèi)分枝期、始花-分枝期、開(kāi)花期、成熟期的最大值和最小值均分別高于親本最大值和小于親本最小值，群體內(nèi)除開(kāi)花期、開(kāi)花-分枝、成熟期外，其余各性狀均值均小于雙親均值。各性狀變異系數(shù)為5.01%～28.81%，其中變異系數(shù)最小的是分枝期，始花期-分枝期變異系數(shù)最大，以上結(jié)果說(shuō)明各性狀在群體個(gè)體之間均得到較好的分離。8個(gè)性狀的遺傳力在42.24%～82.38%之間，其中三葉期、始花期、始花-分枝期和成熟期的遺傳力較高，均大于70%；分枝期、開(kāi)花-分枝期的遺傳力均小于50%，表明二者的遺傳力較低。除出苗期、三葉期外，其余性狀偏度絕對(duì)值均小于或近似等于1，說(shuō)明這些性狀近似符合正態(tài)分布；除分枝期和開(kāi)花-分枝期外，其余性狀偏度均大于0，分枝期和開(kāi)花-分枝期表型數(shù)據(jù)分布向右偏，其他性狀表型數(shù)據(jù)分布向左偏，其中出苗期的偏度為1.6，呈明顯向左偏。除始花期、始花-分枝外，其他性狀峰度的絕對(duì)值均大于0.5；始花期、始花-分枝的峰度小于0，表明這2個(gè)性狀表型分布不太集中。從圖1可以看出，群體各性狀值均呈連續(xù)分布，說(shuō)明這些性狀適合QTL分析。

表1 RIL群體各生育期性狀的分布特征

2.2 綠豆生育期性狀相關(guān)性分析

依據(jù)8個(gè)性狀的BLUE數(shù)據(jù)進(jìn)行各生育期性狀之間的相關(guān)分析，結(jié)果(表2)表明，出苗期與分枝期、始花期、開(kāi)花-分枝間隔期，三葉期與成熟期以及分枝期與成熟期均呈顯著正相關(guān)；三葉期與分枝期，分枝期與開(kāi)花-分枝間隔期，始花期與始花-分枝間隔期、開(kāi)花期、開(kāi)花-分枝間隔期、成熟期，始花-分枝間隔期與開(kāi)花期、開(kāi)花-分枝間隔期、成熟期，開(kāi)花期與開(kāi)花-分枝間隔期、成熟期，開(kāi)花-分枝間隔期與成熟期均呈極顯著正相關(guān)；其中始花期與始花-分枝間隔期相關(guān)性最強(qiáng)(0.861)，表明始花期在決定始花-分枝間隔期起關(guān)鍵性作用，其次為開(kāi)花期與成熟期(0.737)；分枝期與始花-分枝間隔期呈極顯著負(fù)相關(guān)(-0.302)，表明分枝期對(duì)始花-分枝間隔期起負(fù)作用。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

共得到親本間具有多態(tài)性且在RIL群體中帶型清晰的引物20對(duì)，多態(tài)性比率7.2%(圖 2)。這些分子標(biāo)記連同Liu等所使用的313個(gè)標(biāo)記[14]，通過(guò)QTL IciMaping V4.0作圖[20]，得到1張新的綠豆遺傳圖譜，加密后圖譜的各項(xiàng)特征較原圖譜均有所改變(圖3)。

表2 綠豆生育期相關(guān)性狀間的相關(guān)性分析

Liu 等的原圖譜由11個(gè)連鎖群組成，包含313個(gè)分子標(biāo)記，總長(zhǎng)為1 010.18 cM[14]。新圖譜包含11個(gè)連鎖群，333個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，圖譜總長(zhǎng)為 1 417.29 cM。原圖譜各連鎖群標(biāo)記數(shù)為19～74個(gè)，平均28.45個(gè)，其中標(biāo)記最少的是LG2、LG7，各連鎖群平均標(biāo)記數(shù)為19個(gè)，LG4標(biāo)記數(shù)最多，包含74個(gè)標(biāo)記。各標(biāo)記間距離在 2.14～4.29 cM之間，平均3.37 cM，加密后各連鎖群密度為 2.14～6.24 cM，平均密度為4.26 cM。新圖譜標(biāo)記間平均距離有所增大，是由于新圖譜LG1、LG2連鎖群中存在2個(gè)大于40 cM的空隙，整合后圖譜有所延長(zhǎng)，對(duì)綠豆基因組的覆蓋率也極大增加。除LG4、LG9未新加標(biāo)記外，其余連鎖群的長(zhǎng)度都發(fā)生了較大改變，如LG1連鎖群新增標(biāo)記4個(gè)，長(zhǎng)度由59.74 cM 延長(zhǎng)為 128.07 cM；LG10連鎖群新增標(biāo)記3個(gè)，長(zhǎng)度由82.42 cM 延長(zhǎng)到116.63 cM；LG5連鎖群新增2個(gè)標(biāo)記，長(zhǎng)度由65.46 cM 延長(zhǎng)到91.96 cM。

標(biāo)記位置隨著新標(biāo)記的加入而有所變動(dòng)。如第1連鎖群上MUS275～HAAS_VR_1620這9個(gè)標(biāo)記、第6連鎖群HAAS_VR_2489～CEDG-144這9個(gè)標(biāo)記在新標(biāo)記加入后，標(biāo)記間的方向、距離均有所改變，同時(shí)相鄰標(biāo)記間的位置也有所改變，但未發(fā)生連鎖水平上的改變。新建圖譜333個(gè)標(biāo)記中，偏分離標(biāo)記數(shù)72個(gè)(21.62%，P<0.05)，各連鎖群偏分離標(biāo)記數(shù)在1(LG6、LG10)～17(LG1)之間(表3)。新加標(biāo)記中嚴(yán)重偏分離(P<0.001)的標(biāo)記主要位于LG1上，且偏分離的標(biāo)記主要偏向于父本，與Liu等的圖譜[14]類(lèi)似。

2.4 生育期相關(guān)性狀的 QTL分析

本研究對(duì)綠豆8個(gè)生育期相關(guān)性狀的BLUE數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析，共檢測(cè)到15個(gè)QTL位點(diǎn)，成熟期檢測(cè)到4個(gè)QTL位點(diǎn)，出苗期檢測(cè)到3個(gè)QTL位點(diǎn)，三葉期、開(kāi)花期各檢測(cè)到2個(gè)QTL位點(diǎn)，分枝期、始花期、始花-分枝間隔期以及開(kāi)花-分枝間隔期均檢測(cè)到1個(gè)QTL位點(diǎn)。

共檢測(cè)到3個(gè)出苗期(GD)QTL位點(diǎn)。其中第1連鎖群(LG1)的MUS275～CEDG-150、第2連鎖群(LG2)的Vr11-473～Mchr11-45以及第6連鎖群(LG6)的MUS118～MUS35標(biāo)記之間檢測(cè)各到1個(gè)QTL位點(diǎn)(GD1a、GD2a、GD6a)，貢獻(xiàn)率分別為59.24%、63.85%、6.97%，其中GD1a、GD2a位點(diǎn)對(duì)出苗期有較大貢獻(xiàn)，是決定出苗期的大效應(yīng)位點(diǎn)。3個(gè)QTL位點(diǎn)加性效應(yīng)均為負(fù)值，平均加性效應(yīng)為-0.51，平均可使出苗期減少0.51 d。

表3 圖譜加密前后定位的QTL比較

共檢測(cè)到2個(gè)三葉期(TLD)QTL位點(diǎn)。其中LG1的MUS275～CEDG-150、LG6的MUS168～Mchr7-23之間各檢測(cè)到1個(gè)QTL(TLD1a、TLD6a)，貢獻(xiàn)率分別為26.76%、10.29%，表明前者是決定三葉期的大效應(yīng)位點(diǎn)。TLD1a加性效應(yīng)為負(fù)，可使三葉期減少1.86 d，TLD6a加性效應(yīng)為正，可使三葉期增加0.64 d。

檢測(cè)到1個(gè)分枝期(BS)QTL位點(diǎn)(BS9a)，位于第9連鎖群的Mchr10-9～Mchr5-37標(biāo)記之間，該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為5.95%，可能屬于微效基因。該位點(diǎn)加性效應(yīng)為負(fù)，說(shuō)明該位點(diǎn)可縮短分枝期。

檢測(cè)到1個(gè)始花期(FFD)QTL位點(diǎn)(FFD2a)，位于第 2 連鎖群的MUS171～MUS617標(biāo)記之間，該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率較大(11.61%)，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)FFD的貢獻(xiàn)較大，可能屬于大效應(yīng)位點(diǎn)。該位點(diǎn)加性效應(yīng)為-0.96，說(shuō)明該位點(diǎn)可使FFD縮短0.96 d。

檢測(cè)到1個(gè)始花-分枝間隔期(FFD-BS)QTL位點(diǎn)(FFD-BS2a)，位于第2連鎖群的MUS171～MUS617標(biāo)記之間，該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為10.44%，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)FFD-BS的貢獻(xiàn)較大。位點(diǎn)加性效應(yīng)為負(fù)，說(shuō)明該位點(diǎn)可縮短FFD-BS。

共檢測(cè)到2個(gè)開(kāi)花期(FD)QTL位點(diǎn)。其中LG1的MUS275～CEDG-150、LG2的Vr11-473～Mchr11-45標(biāo)記之間各檢測(cè)到1個(gè)QTL位點(diǎn)(FD1a、FD2a)，單個(gè)位點(diǎn)貢獻(xiàn)率分別為36.95%、51.30%，說(shuō)明二者對(duì)FD的貢獻(xiàn)均較大，均屬于大效應(yīng)位點(diǎn)。2個(gè)位點(diǎn)加性效應(yīng)均為負(fù)，平均為 -3.56，平均可使FD減少3.56 d。

檢測(cè)到1個(gè)開(kāi)花-分枝間隔期(FD-BS)QTL位點(diǎn)(FD-BS11a)，位于第11連鎖群的Mchr10-49～HAAS_VR_1519標(biāo)記之間，該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為11.09%，說(shuō)明該位點(diǎn)對(duì)FD-BS的貢獻(xiàn)較大。該位點(diǎn)加性效應(yīng)為0.62，說(shuō)明該位點(diǎn)可使FD-BS增加0.62 d。

共檢測(cè)到4個(gè)成熟期(MD)QTLs 位點(diǎn)。分別為位于第1連鎖群MUS275～CEDG-150與第2連鎖群Vr11-473～Mchr11-45標(biāo)記之間的MD1a、MD2a，以及LG11 Mchr10-1～Mchr10-5與Mchr10-27～Mchr10-30標(biāo)記之間的MD11a、MD11b。MD1a、MD2a均屬于大效應(yīng)位點(diǎn)(貢獻(xiàn)率分別為37.77%、44.76%)，且加性效應(yīng)均為負(fù)，累計(jì)可使MD減少8.95 d。MD11a、MD11b可能屬于微效基因(貢獻(xiàn)率分別為6.19%、8.36%)，前者加性效應(yīng)為負(fù)，后者加性效應(yīng)為正(圖4、表4)。

3 討論與結(jié)論

3.1 綠豆生育期性狀統(tǒng)計(jì)學(xué)性分析

生育期是豆類(lèi)作物產(chǎn)量形成的重要因素[21]，研究綠豆生育期相關(guān)性狀的遺傳規(guī)律是了解其產(chǎn)量形成機(jī)制的重要途徑之一。綠豆生育期相關(guān)性狀主要包括出苗期、三葉期、分枝期、始花期、開(kāi)花期、始熟期、成熟期[8]。本研究中，出苗期、三葉期、始花-分枝間隔期的變異系數(shù)均大于10%，最高達(dá)28.81%，開(kāi)花期、成熟期變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)前期的遺傳受環(huán)境影響大于生殖生長(zhǎng)期，與馬樂(lè)等的研究結(jié)果[22，6]類(lèi)似。Sompong等研究發(fā)現(xiàn)，綠豆成熟期與始花期呈極顯著正相關(guān)[23，16]。梅麗研究表明， 與生育期的關(guān)聯(lián)度由高到低排序?yàn)殚_(kāi)花期、始花期、出苗期[6]。綠豆開(kāi)花期和成熟期遺傳力高且遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，Yimram等對(duì)340個(gè)綠豆種質(zhì)材料的分析表明，開(kāi)花期、成熟期廣義遺傳力分別為0.75、0.71[24]。Kajonphol等研究發(fā)現(xiàn)，綠豆始花期、始熟期遺傳力分別為0.89、0.91[16]。馬樂(lè)等研究表明，綠豆開(kāi)花期和成熟期的廣義遺傳力在0.95以上[18]。本研究中綠豆始花期、開(kāi)花期、成熟期遺傳力均較高，分別為0.77、0.59、0.74。以上結(jié)果說(shuō)明，始花期、開(kāi)花期在影響綠豆生育期中扮演重要角色，育種實(shí)踐中關(guān)注始花期、開(kāi)花期對(duì)選育不同生育期長(zhǎng)短的綠豆新品種更有效，開(kāi)花期、成熟期遺傳力高，有利于相關(guān)基因的定位和圖位克隆[25，26]。

表4 綠豆生育期相關(guān)性狀的QTL

3.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

構(gòu)建高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜是基因定位前提條件之一[27]。前人所繪制的綠豆遺傳連鎖圖譜主要基于栽培綠豆和野生綠豆雜交形成的群體，主要原因是栽培綠豆與栽培綠豆的種間雜交很難篩選出多態(tài)性標(biāo)記[13]。Chankaew 等利用綠豆的433個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)2種栽培綠豆KPS1和V4718之間進(jìn)行多態(tài)性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有27個(gè)(8.85%) SSR標(biāo)記在親本之間存在多態(tài)性[2]；Liu等使用Isemura等的JP211874×JP229096(野生綠豆×栽培綠豆)綠豆群體中430個(gè)表現(xiàn)出多態(tài)性SSR標(biāo)記，只有24個(gè)顯示出多態(tài)性[14-15]。本研究應(yīng)用275對(duì)SSR引物對(duì)親本VC2917和鸚哥綠進(jìn)行篩選，親本間共得到多態(tài)性引物20對(duì)，親本間多態(tài)性為7.2%，使得本研究設(shè)計(jì)的多態(tài)性SSR標(biāo)記具有價(jià)值。

整合后遺傳連鎖圖與Liu等的原圖譜[14]基本一致，但也有一些標(biāo)記位置隨著連鎖圖譜整合發(fā)生變動(dòng)，主要變動(dòng)為第1、第6連鎖群上的位置發(fā)生顛倒。趙丹等整合綠豆遺傳連鎖圖譜時(shí)也發(fā)生類(lèi)似狀況，認(rèn)為這可能是因標(biāo)記偏分離現(xiàn)象的影響[28]。本研究整合的綠豆遺傳連鎖圖譜中有72個(gè)偏分離標(biāo)記，偏分離比率為21.75%，低于趙丹等構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖譜[28-30]，高于Isemura等構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖譜[15]。這可能是因?yàn)楸狙芯克萌后w為栽培綠豆×栽培綠豆構(gòu)建的RIL群體，避免了野生親本攜帶的不利位點(diǎn)，但與回交群體相比，RIL群體偏分離比率一般更高，主要原因是RIL群體構(gòu)建時(shí)人為抽樣的偏差以及多代的自然選擇[14，28]。

3.3 生育期相關(guān)性狀的 QTL分析

本研究通過(guò)1點(diǎn)3年大田試驗(yàn)，對(duì)8個(gè)生育期相關(guān)性狀的BLUE數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，各性狀均檢測(cè)到QTL位點(diǎn)。數(shù)量性狀的表達(dá)極易受環(huán)境的影響，在生長(zhǎng)環(huán)境不同時(shí)定位的結(jié)果可能不同[7]，本研究與馬樂(lè)使用相同群體在同一試驗(yàn)地點(diǎn)不同年份進(jìn)行QTL定位，將三葉期QTL定位在LG6(MUS168～Mchr7-23)[22]。本研究在該區(qū)間外檢測(cè)1個(gè)QTL，位于LG2的MUS275～CEDG-150標(biāo)記之間，同時(shí)也說(shuō)明該性狀可能為由位于不同染色體的多個(gè)QTL調(diào)控。大效應(yīng)QTL一般是在不同生境下均可以檢測(cè)到的穩(wěn)定QTL，存在相關(guān)基因的概率更大，是實(shí)現(xiàn)圖位克隆的關(guān)鍵區(qū)域[31-32]與梅麗研究結(jié)果[6]類(lèi)似，本研究將出苗期定位在第1、第2連鎖群；本研究將開(kāi)花期QTL定位在LG1、LG2，與Isemura等(LG2、LG4、LG6 和 LG11)[15]、梅麗等(LG2、LG9、和 LG12)[7]及Somta等(LG2、LG4、LG5和LG6)[17]的研究結(jié)果類(lèi)似，且大效應(yīng)位點(diǎn)位于LG2，說(shuō)明第2連鎖群上存在決定開(kāi)花期性狀的關(guān)鍵基因；與Sompong等的研究結(jié)果[23]相比，本研究在LG2檢測(cè)到1個(gè)成熟期大效應(yīng)QTL，與Isemura等類(lèi)似[15-16]。上述大效應(yīng) QTL 可以為今后該性狀進(jìn)一步研究提供借鑒，可為今后分子標(biāo)記輔助選育新型早熟綠豆品種提供新的基因位點(diǎn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)QTL富集區(qū)，第1連鎖群的MUS275～CEDG-150標(biāo)記區(qū)間富集了開(kāi)花期、成熟期2個(gè)性狀的QTL位點(diǎn)，第2連鎖群的MUS171～MUS617標(biāo)記區(qū)間檢測(cè)到控制始花期、始花-分枝間隔期的QTL，這種QTL的富集現(xiàn)象在梅麗等的研究中也有報(bào)道[6，14，19]。Guan等認(rèn)為，QTL簇(QTL cluster)或QTL富集區(qū)是一因多效或者多個(gè)基因緊密連鎖的結(jié)果[33]。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在QTL成束的區(qū)域，第2連鎖群Vr11-473～Mchr11-45區(qū)間的不同位點(diǎn)檢測(cè)到控制出苗期、開(kāi)花期、成熟期關(guān)鍵性狀QTL位點(diǎn)，Tuberosa 等認(rèn)為，控制同一性狀的QTL可能分布于染色體上的一個(gè)集中區(qū)域，而不是隨機(jī)分布[34]。然而目前所用圖譜依然無(wú)法滿(mǎn)足圖位克隆的需要，今后有必要借助全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study)技術(shù)，有針對(duì)性地進(jìn)行精細(xì)定位。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)與這些生育期性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記，通過(guò)回交育種與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，選育出新的綠豆早熟品種，為綠豆育種創(chuàng)造優(yōu)異新材料。