HPLC同時(shí)測定姜黃醒酒飲料中3種姜黃素含量

孔文茹，李菲菲，尤鈺琳，王智璠，紀(jì)建波

（山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012）

姜黃（Curcumae Longae Rhizoma）是姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的干燥根莖，歷版《中國藥典》均收載其為常用中藥，具有破血行氣，通經(jīng)止痛等功效，用于胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，癥瘕，風(fēng)濕肩臂疼痛，跌撲腫痛[1]。姜黃主要含揮發(fā)油類和姜黃素類，在中藥中屬活血藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)姜黃及其主要有效成分姜黃素（curcumin）具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)肝臟等多種藥理活性[2]。因其具有低毒、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，常被用作一種天然的食品添加劑。

有研究報(bào)道，姜黃素能減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷[3]；姜黃素還可通過調(diào)節(jié)線粒體功能障礙和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕小鼠慢性酒精性肝損傷[4]，通過顯著降低乙醇誘導(dǎo)的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平對肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用[5]。目前，很多醒酒飲料中加入了姜黃素，以減輕酒精對肝臟的損傷。

迄今已有許多方法用于姜黃中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的定性和定量分析，比如高效液相色譜法（HPLC）[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8-10]、超臨界流體色譜[11]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、薄層色譜法[13]等。HPLC因分離效果好，靈敏度高，選擇性好，重現(xiàn)性高，常用于姜黃素類化合物的含量測定。

本研究建立了HPLC定量分析醒酒飲料中姜黃素的方法，成功應(yīng)用于市場中含姜黃素的醒酒飲料中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司，包括G1311B四元梯度泵，G1367E自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測器，Agilent色譜工作站）；Mettler AG135十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ5200DE數(shù)控超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

市售姜黃醒酒飲料（編號：JH-1～JH-5）；姜黃素對照品（批號：C12348612，含量：98 %，上海麥克林生化科技有限公司）；去甲氧基姜黃素對照品（批號： RP210303，含量：99.51 %，成都麥德生科技有限公司）；雙去甲氧基姜黃素對照品（批號：F2122080，含量：98 %，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇，乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國Mreda公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取姜黃素對照品10.11 mg、去甲氧基姜黃素對照品9.91 mg、雙去甲氧基姜黃素對照品10.01 mg，置于10 ml量瓶中，分別加甲醇定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液 精密吸取醒酒飲料2 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲提取30 min，冷至室溫，取上清，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），連接C18保護(hù)柱（4.0 mm×3.0 mm，5 μm，Phenomenex）；流動相：乙腈（A），0.04 %甲酸水溶液（B），按表1梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長為425 nm；進(jìn)樣量：5 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5 μl，分別注入高效液相色譜儀，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果供試品溶液中姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素在對照品色譜峰相應(yīng)位置有色譜峰流出，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）和樣品（B）的HPLC圖譜

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素對照品溶液各適量，加入甲醇，配制成濃度為250 μg/ml的混合對照品溶液，逐級稀釋，配制成濃度為125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 μg/ml的混合對照品溶液。其中姜黃素的線性實(shí)驗(yàn)采用濃度為250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 μg/ml的混合對照品溶液，去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素的線性實(shí)驗(yàn)采用濃度為125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 μg/ml的混合對照品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5 μl，測定峰面積。以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，見表2。結(jié)果表明，姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素在各自的線性范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得姜黃素、去甲基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD值分別為0.34 %，0.37 %，1.03 %，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0，2，6，12，20，30 h按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD值分別為0.23 %，0.32 %，0.44 %，表明供試品溶液在該條件下30 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取姜黃醒酒飲料6份，每份2 ml，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素的平均含量為19.71，2.65，0.28 mg，RSD值分別為0.83 %，0.90 %，0.67 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 檢測限和定量限 取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用甲醇溶液逐級稀釋后進(jìn)樣分析，測得姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的檢測限（S/N=3）分別為0.48，0.24，0.24 μg，定量限（S/N=10）分別為0.98，0.48，0.48 μg。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量（姜黃素386.1 μg/ml、去甲氧基姜黃素51.8 μg/ml、雙去甲氧基姜黃素5.4 μg/ml）的姜黃醒酒飲料3份，每份2 ml，分別置于10 ml量瓶中，再分別加入1 mg/ml的對照品溶液適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果姜黃素、去甲氧基姜黃素及雙去甲氧基姜黃素的平均加樣回收率為92.67 %～106.77 %，RSD為1.10 %～2.65 %。表明該方法準(zhǔn)確性良好，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4.7 樣品含量測定 分別吸取不同品牌的姜黃醒酒飲料2 ml，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定的含量測定方法測定樣品中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的含量。結(jié)果見表4。

表4 不同品牌姜黃醒酒飲料中3種姜黃素的含量測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC測定不同品牌姜黃醒酒飲料中姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素含量的方法，該方法準(zhǔn)確、靈敏。通過不同品牌的姜黃醒酒飲料的含量測定結(jié)果可看出，姜黃醒酒飲料中姜黃素的添加量最多，雙去甲氧基姜黃素的添加量很少甚至沒有。