白酒中三氯蔗糖的HPLC及UPLC-MS/MS檢測(cè)對(duì)比研究

馬雪豐，陳 果，唐韻熙，秦德萍

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

三氯蔗糖（sucralose），又名蔗糖素，相對(duì)分子質(zhì)量為396.01，具有高穩(wěn)定性、高甜度（等量蔗糖的600倍）、甜味純正、零熱量、不被人體吸收、不引起齲齒等優(yōu)點(diǎn)[1-3]，因此被廣泛應(yīng)用到調(diào)味乳、糖果、果醬、冷凍飲品、水果干、醬、醋、配制酒、濃縮果汁等加工食品中[4-6]。但三氯蔗糖不是天然成分，若超量使用，可能會(huì)引起各種形式的毒性表現(xiàn)[7-8]?，F(xiàn)我國(guó)在《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）中規(guī)定不允許三氯蔗糖添加至蒸餾酒中[9]。但一些白酒生產(chǎn)企業(yè)為迎合消費(fèi)者需求，在白酒中加入三氯蔗糖改善酒體口感，從而賺取高額利潤(rùn)，干擾了行業(yè)的健康發(fā)展[10-11]。近年，在國(guó)家有關(guān)部門對(duì)全國(guó)白酒的抽檢中，時(shí)常有濫用三氯蔗糖的現(xiàn)象發(fā)生。目前，文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)三氯蔗糖的方法主要有離子色譜法[12-13]、高效液相色譜法（HPLC）[14-16]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[17-18]等。其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的是HPLC，該方法靈敏度較低，選擇性較差，且存在著易出現(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題。鑒于此，本文利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）具有高選擇性、高靈敏度及能提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)白酒中三氯蔗糖進(jìn)行檢測(cè)，并與HPLC進(jìn)行對(duì)比。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配示差檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）； Agilent 1290-API 4000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠）。

1.2 試藥

樣品：市售白酒。

試劑：三氯蔗糖對(duì)照品（Sigma-Aldrich公司），乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；甲醇（色譜醇，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；超純水由Milli-Q水純化設(shè)備自制。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取三氯蔗糖對(duì)照品0.01000 g，置于10 ml量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.00 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。將對(duì)照品儲(chǔ)備液用超純水逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為0.020，0.050，0.100，0.200，0.400 mg/ml的系列對(duì)照品溶液，待HPLC測(cè)定；質(zhì)量濃度分別為20.0，40.0，80.0，100.0，200.0，400.0 ng/ml的系列對(duì)照品溶液，待UPLC-MS/MS測(cè)定。

2.2 樣品前處理方法

2.2.1 HPLC 稱取樣品5 g（精確到0.01 g），置于蒸發(fā)皿中，于沸水浴上蒸至近干，將殘?jiān)?.00 ml水溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾入樣品瓶中，待上機(jī)分析。

2.2.2 UPLC-MS/MS 稱取樣品5 g（精確到0.01 g），置10 ml量瓶中，用水混勻后定容至刻度，用0.22 m濾膜過(guò)濾入樣品瓶中，待上機(jī)分析。

2.3 HPLC分析條件

色譜柱：Waters Symmetry Shield C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（15:85），等度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；示差檢測(cè)器檢測(cè)池溫度：35 ℃。

2.4 UPLC-MS/MS分析條件

UPLC條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A：0.1 %甲酸水溶液，B：甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μl。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧（IS）電壓：-4500 V；霧化氣（GS1）壓力： 55 psi；氣簾氣（CUR）壓力：25 psi；輔助氣（GS2）壓力：55 psi；離子源溫度：500 ℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）見表2。

表2 MRM條件

3 結(jié)果與討論

3.1 兩種方法前處理及檢測(cè)條件的優(yōu)化

3.1.1 HPLC 三氯蔗糖在紫外光區(qū)無(wú)特征吸收峰，因此采用示差折光通用檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。但該檢測(cè)器選擇性差，白酒中的主要成分乙醇和一些微量的芳香族化合物對(duì)液相系統(tǒng)產(chǎn)生基質(zhì)干擾，影響目標(biāo)物質(zhì)的分離。因此將待測(cè)酒樣經(jīng)水浴蒸發(fā)去除醇類等易揮發(fā)組分，再通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中乙腈的比例使目標(biāo)物質(zhì)三氯蔗糖得到分離（見圖1）。從圖1可見三氯蔗糖峰位處平穩(wěn)清晰，無(wú)其他峰的出現(xiàn)。

圖1 空白溶劑（A）、對(duì)照品溶液（B）、加標(biāo)樣液（C）的HPLC圖譜

3.1.2 UPLC-MS/MS 將樣品稀釋后直接分析。分別考察流動(dòng)相0.1 %乙酸水溶液-甲醇（40:60）、10 mmol/L乙酸胺水溶液-甲醇梯度洗脫、0.1 %甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫3種洗脫條件對(duì)目標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用0.1 %甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫，峰形良好，干擾少（見圖2）。采用多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式進(jìn)行測(cè)定，具有選擇性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，避免了液相色譜僅通過(guò)色譜峰的保留時(shí)間定性而導(dǎo)致假陽(yáng)性的可能。

3.2 兩種方法回歸方程、線性關(guān)系和檢出限的比較

分別采用HPLC和UPLC-MS/MS測(cè)定三氯蔗糖系列對(duì)照品溶液。以濃度為橫坐標(biāo)（X）、其相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)（r）。以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為定量限。兩種方法回歸方程、線性范圍和檢出限見表3。對(duì)比兩種方法，UPLC-MS/MS方便快捷，檢出限更低。因此UPLC-MS/MS測(cè)定白酒中的三氯蔗糖更具優(yōu)勢(shì)。

表3 三氯蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限、定量限

3.3 兩種方法回收率和精密度的比較

選取空白樣品，加入三氯蔗糖對(duì)照品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。加標(biāo)濃度分為低、中、高3個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)6次。計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示兩種方法回收率良和精密度良好，但UPLC-MS/MS的靈敏度更高，可用于白酒中痕量三氯蔗糖的檢測(cè)。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.4 樣品的測(cè)定

采用HPLC和UPLC-MS/MS分別對(duì)10個(gè)白酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。結(jié)果HPLC未檢出三氯蔗糖；UPLC-MS/MS檢出3號(hào)白酒中添加微量三氯蔗糖。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

本文對(duì)HPLC和UPLC-MS/MS測(cè)定白酒中三氯蔗糖的檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示UPLC-MS/MS前處理簡(jiǎn)單快捷，定性更加準(zhǔn)確，且靈敏度高，能滿足白酒中三氯蔗糖的檢測(cè)要求。