3種客觀賦權(quán)法比較優(yōu)選健胃除痞顆粒的提取工藝

李潔環(huán)，張建軍，馮健英，陳雪婷，徐文杰，李智勇

［廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095］

健胃除痞方由烏藥、柴胡、白芍、佛手、豆蔻、佩蘭等藥味組成，具有疏肝行氣、健胃除脹、消痞除滿之功效，臨床上用于治療慢性胃炎、萎縮性胃炎等引起的痞滿嘈雜、胃脹、噯氣、胃痛灼熱等癥。原方湯劑內(nèi)服，臨床療效顯著，但存在煎煮、攜帶、使用不方便等缺點，擬將其開發(fā)制成顆粒劑，現(xiàn)對其水提取工藝進行研究。由于中藥化學成分復雜，選擇單一成分的含量進行質(zhì)量監(jiān)測不足以全面反映制劑的質(zhì)量；因此，本研究選擇烏藥中去甲異波爾定質(zhì)量濃度、白芍中芍藥苷質(zhì)量濃度以及固形物質(zhì)量作為評價指標，多指標綜合評價優(yōu)化提取工藝條件。在進行綜合評價時，各指標權(quán)重系數(shù)的確定尤為關(guān)鍵，其合理性直接影響評價結(jié)果的可靠性和正確性[1]?？陀^賦權(quán)法是依據(jù)原始數(shù)據(jù)間的相關(guān)關(guān)系，通過一定的數(shù)學方法，經(jīng)統(tǒng)計分析、計算，來獲得權(quán)重的一種賦權(quán)方法，其結(jié)果不依賴于人的主觀判斷，不受人為主觀偏好的干擾，客觀性強，使評價結(jié)果更具可信性[2]。本文擬采用熵權(quán)法、標準離差法、基于指標相關(guān)性的權(quán)重確定方法（criteria impor‐tance through intercriteria correlation,CRITIC）建立權(quán)重，分析比較3種客觀賦權(quán)法得到的結(jié)果，優(yōu)化確定最佳提取工藝條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋[邦西儀器科技（上海）有限公司]；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JJ500 型電子天平（0～500 g/0.01 g，常熟市雙杰測試儀器廠）；XS205DU 電子分析天平（0～220 g/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司）；PTHW 型調(diào)溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Heidolph 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；DHG-9203A鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

烏藥等飲片購自廣州市中芝源中藥有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦研究員鑒定，烏藥（產(chǎn)地：浙江）為樟科植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kos-term.干燥塊根的加工炮制品，白芍（產(chǎn)地：安徽）為毛莨科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.干燥根的加工炮制品，其余飲片經(jīng)鑒定均為正品。試驗所用飲片經(jīng)檢驗，質(zhì)量均符合《中國藥典》2020年版一部各飲片項下的有關(guān)規(guī)定。

去甲異波爾定（批號111825-201201）、芍藥苷（批號110736-201539）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純（德國默克），水為蒸餾水，甲酸、磷酸等其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 評價指標的建立

2.1.1 去甲異波爾定、芍藥苷的測定

2.1.1.1 色譜條件 去甲異波爾定：Kromasil 100-5-C18色譜柱，以乙腈∶（0.5%甲酸-0.1%三乙胺）（體積比9∶91）為流動相，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，流速1 mL/min。芍藥苷：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸（體積比13∶87）為流動相，柱溫25 ℃，檢測波長230 nm，流速1 mL/min。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 分別取去甲異波爾定、芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為298.4、280.9 μg/mL 的儲備液。取上述去甲異波爾定、芍藥苷對照品儲備液各0.25、0.6 mL，分別置1 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為74.6、168.5 μg/mL 的去甲異波爾定、芍藥苷對照品溶液。

2.1.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例，稱取烏藥等飲片260 g，加水提取2 次，每次加8 倍量水，提取1 h，合并提取液，200 目篩濾過，濾液濃縮并定容至250 mL。精密移取濃縮液1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）25 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得去甲異波爾定供試品溶液。另精密量取濃縮液1 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇適量，同法操作制備芍藥苷供試品溶液。

2.1.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，稱取除烏藥外的其余飲片，按上述供試品溶液的制備方法制備缺烏藥的陰性對照溶液。同法制備缺白芍的陰性對照溶液。

2.1.1.5 專屬性考察 精密吸取上述去甲異波爾定對照品、供試品和缺烏藥的陰性對照溶液各8 μL 進樣測定，結(jié)果表明，去甲異波爾定對照品和供試品溶液在相同位置處有一色譜峰，陰性對照溶液未見該色譜峰。另精密吸取上述芍藥苷對照品、供試品和缺白芍的陰性對照溶液各5 μL 進樣測定，結(jié)果表明，芍藥苷對照品和供試品溶液在相同位置處有一色譜峰，陰性對照溶液未見該色譜峰。上述色譜條件下，去甲異波爾定、芍藥苷基本上可達到基線分離，峰對稱性良好，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以去甲異波爾定峰計算不低于5 000，以芍藥苷峰計算不低于2 000，表明去甲異波爾定、芍藥苷的測定方法專屬性良好，色譜圖見圖1和圖2。

圖1 去甲異波爾定對照品（A）、供試品（B）、陰性樣品（C）的HPLC圖Figure 1 HPLC diagrams of the reference substance（A）,test substance（B）and negative sample（C）of norisoboldine

圖2 芍藥苷對照品（A）、供試品（B）、陰性樣品（C）的HPLC圖Figure 2 HPLC diagrams of the reference substance（A）,test substance（B）and negative sample（C）of paeoniflorin

2.1.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1.2”項下去甲異波爾定對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為29.84、59.68、89.52、119.4、149.2、179.0 μg/mL 的對照品溶液，按上述色譜條件進樣4 μL，以進樣量（X,ng）對峰面積（Y）進行線性回歸，得去甲異波爾定的回歸方程為Y=2.282X-14.71，r=0.999 9，表明去甲異波爾定進樣量在119.4～716.2 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密量取“2.1.1.2”項下芍藥苷對照品儲備液0.15、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL，分別置于1 mL 量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為42.13、84.26、112.4、140.4、168.5、224.7 μg/mL的對照品溶液，按上述色譜條件進樣5 μL，以進樣量（X,ng）對峰面積（Y）進行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為Y=1.493X-29.47，r=0.999 9，表明芍藥苷進樣量在210.7～1124 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.1.7 方法學考察 去甲異波爾定：精密度、重復性、24 h 穩(wěn)定性試驗去甲異波爾定峰面積RSD 分別為1.06%、1.72%、1.93%，平均加樣回收率為99.94%，RSD 為1.32%。芍藥苷：精密度、重復性、24 h 穩(wěn)定性試驗芍藥苷峰面積RSD 分別為1.34%、1.57%、1.89%，平均加樣回收率為99.33%，RSD為1.14%。

2.1.2 固形物質(zhì)量的測定 精密吸取各樣品濃縮液50 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照干燥失重測定法（《中國藥典》2020年版四部0831項）測定，按公式：固形物質(zhì)量=W÷50×250 計算固形物質(zhì)量，其中W為50 mL濃縮液的固形物質(zhì)量。

2.2 正交試驗設計及結(jié)果

2.2.1 正交試驗設計

采用L9（34）正交試驗法，以烏藥中去甲異波爾定質(zhì)量濃度、白芍中芍藥苷質(zhì)量濃度和固形物質(zhì)量為評價指標，對影響提取工藝的提取次數(shù)、提取時間、加水量進行考察。

2.2.2 樣品的制備

按處方比例，稱取烏藥、柴胡、白芍等飲片9份，每份260 g，按表1正交試驗設計表的安排進行提取，提取液200目篩濾過，濾液濃縮并定容至250 mL。

2.2.3 樣品評價指標的測定

按“2.1.1.1”項色譜條件進樣測定（去甲異波爾定樣品進樣8 μL，芍藥苷樣品進樣5 μL），計算9 份正交樣品中去甲異波爾定和芍藥苷質(zhì)量濃度，并測定固形物質(zhì)量，結(jié)果見表1。

2.2.4 數(shù)據(jù)的無量綱化處理[3-4]為消除各指標量綱不同對方案決策的影響，先對表1數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，使數(shù)據(jù)處于［0，1］之間，公式如下：

表1 正交試驗設計及結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental design and results

式中：Yij為第i個評價對象的第j個評價指標的無量綱化處理數(shù)值；Xij為第i個評價對象的第j個評價指標的原始數(shù)值；maxXij和minXij分別表示第i個評價對象在第j個評價指標上的最大值和最小值。數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表2。

表2 數(shù)據(jù)無量綱化處理結(jié)果Table 2 Data dimensionless processing results

2.2.5 指標成分權(quán)重的確定

2.2.5.1 熵權(quán)法確定權(quán)重[5-7]熵原本是一個熱力學概念，后被引入信息論中，用來度量信息量的多少。熵權(quán)法中，可以用熵值（Ej）來判斷某個指標的離散程度，其信息熵Ej越小，指標的離散程度越大，變異程度越大，該指標對綜合評價的影響（即權(quán)重Wj）就越大。信息熵Ej、各指標客觀權(quán)重Wj的計算公式如下：

式中：Ej為第j個評價指標的熵值；Pij為第i個評價對象在j指標下的概率；m為被評價對象的數(shù)目；n為評價指標的數(shù)目；Wj為第j個評價指標的權(quán)重。計算結(jié)果見表3、4。

表3 各指標的Pij值Table 3 Pij value of each index

2.2.5.2 標準離差法確定權(quán)重[1,8-9]標準離差法主要是根據(jù)指標變異性的大小來確定權(quán)重。指標的標準差越大，其變異程度就越大，在綜合評價中所起的作用也越大，則其權(quán)重也應越大。反之，指標的標準差越小，表明其指標值的變異程度越小，提供的信息量越小，權(quán)重也應越小。標準差（Sj）、各指標權(quán)重（Wj）的計算公式如下：

表4 各指標的Ej值和Wj值Table 4 Ej and Wj value of each index

式中：Sj為第j個指標無量綱化測度值的樣本標準差；Yij為第i個評價對象的第j個評價指標的無量綱化數(shù)值；為第j個指標無量綱化數(shù)值的樣本平均值；Wj為第j個評價指標的權(quán)重；m為被評價對象的數(shù)目；n為評價指標的數(shù)目。計算結(jié)果見表5。

表5 各指標的Sj 值和Wj值Table 5 Sj and Wj value of each index

2.2.5.3 CRITIC 法確定權(quán)重[10-12]CRITIC 法是一種以評價指標間的對比強度及沖突性作為基礎(chǔ)，綜合衡量客觀權(quán)重的計算方法。對比強度以標準差（Sj）來體現(xiàn)，Sj越大，各方案之間的取值差距越大。沖突性以指標間相關(guān)性為基礎(chǔ)，以Rj的形式來體現(xiàn)，如果兩指標之間具有較強的正相關(guān)，說明兩個指標沖突性較低，表明這兩個指標反應的信息較為相似。設Cj表示第j個指標所包含的信息量，Cj越大，則第j個指標所包含的信息量越大，該指標的相對重要性也就越大，客觀權(quán)重（Wj）就越大。利用SPSS 軟件計算出各評價指標間的相關(guān)系數(shù)（rij）矩陣，結(jié)果見表6。Rj、Cj、Wj計算公式如下：

表6 各指標間的相關(guān)性Table 6 Correlation among indicators

式中：rij為評價指標i和j之間的相關(guān)系數(shù)，n為評價指標的數(shù)目。計算結(jié)果見表7。

表7 各指標的Rj、Cj、Wj值Table 7 Rj、Cj、Wj value of each index

2.2.5.4 綜合評價結(jié)果的比較分析 分別采用經(jīng)熵權(quán)法、標準離差法、CRITIC 法分析得到的權(quán)重系數(shù)對正交試驗結(jié)果進行綜合加權(quán)評分，以去甲異波爾定質(zhì)量濃度、芍藥苷質(zhì)量濃度、固形物質(zhì)量9次試驗的最大值為100 分，將各指標成分的總量分別轉(zhuǎn)換為評分值，再乘以相應的權(quán)重系數(shù)后求和，得綜合評分值，公式如下：

式中：A為去甲異波爾定質(zhì)量濃度，B為芍藥苷質(zhì)量濃度，C為固形物質(zhì)量，max 為正交9 次試驗的最大值，W為權(quán)重系數(shù)。分析結(jié)果見表8。

表8 3種賦權(quán)法綜合評分結(jié)果分析Table 8 Analysis of comprehensive scoring results of three weighting methods

結(jié)果表明，3 種賦權(quán)法得到的綜合評分值相差不大，較為接近，但各正交試驗綜合評分的排序存在微小的差異，分值最高的均是正交5，正交3、6、7、9 的排名有所不同。采用Kendall 協(xié)調(diào)系數(shù)W檢驗對3 種評分結(jié)果進行一致性檢驗[13-15]，結(jié)果顯示：Kendall 協(xié)調(diào)系數(shù)W=0.985，χ2=23.644，P=0.003<0.01，表明3 種賦權(quán)法對各正交試驗的排名具有較高的一致性，其差異不具有統(tǒng)計學意義。由于CRITIC法不僅考慮了指標變異大小對權(quán)重的影響，還考慮到各指標之間的沖突性，更為全面，可減少指標之間信息熵的重疊，更有利于得到可信的評價結(jié)果，綜合考慮，確定采用CRITIC 法確定的權(quán)重系數(shù)進行綜合評分。

2.2.6 正交試驗結(jié)果分析

采用CRITIC 法確定的權(quán)重系數(shù)對正交結(jié)果進行綜合評分，并進行方差分析，結(jié)果見表9、10。

表9 直觀分析表Table 9 Visual analysis

表10 方差分析表Table 10 Variance analysis

結(jié)果表明，因素A（提取次數(shù)）、因素C（加水量）對試驗結(jié)果的影響有統(tǒng)計學意義，因素B（提取時間）對試驗結(jié)果影響無統(tǒng)計學意義。因此，提取工藝條件確定為：A3B1C3，即加水提取3 次，每次加10倍量水，提取1 h。

2.3 驗證試驗

按處方比例，稱取烏藥、柴胡、白芍等飲片3份，每份260 g，按優(yōu)選的工藝條件提取，200 目篩濾過，濾液濃縮并定容至250 mL。照上述方法測定去甲異波爾定質(zhì)量濃度、芍藥苷質(zhì)量濃度、固形物質(zhì)量，結(jié)果見表11。

表11 提取工藝驗證結(jié)果Table 11 Validation results of extraction process

結(jié)果表明：驗證試驗平均綜合評分值為98.12，與正交試驗綜合評分值最大值（98.38）接近，表明優(yōu)選的工藝參數(shù)穩(wěn)定、合理。

3 討論

實驗前期對處方中其他藥味的含量測定方法進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡中柴胡皂苷a、d 的穩(wěn)定性較差，這可能是由于其結(jié)構(gòu)中含有環(huán)氧醚鍵，在高溫條件下易開環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)化；而烏藥中烏藥醚內(nèi)脂由于屬于脂溶性成分，傳統(tǒng)水煎法或水提法不易將它溶出，使它在水提濃縮液中的煎出率低、含量很小[16]；此外，佛手中橙皮苷成分含量測定方法有干擾，因此，均暫不列為評價指標。

現(xiàn)階段的中藥提取工藝綜合評價方法常用的仍然是經(jīng)驗性權(quán)數(shù)法，受決策者主觀上的重視程度影響較大?？陀^賦權(quán)法是一種建立在原始樣本數(shù)據(jù)上，經(jīng)數(shù)學方法統(tǒng)計分析、處理后獲得權(quán)重的方法，它不受人為主觀偏好的干擾，具有較強的數(shù)學理論依據(jù)，客觀性強[2，17]。本文采用熵權(quán)法、標準離差法、CRITIC 法3 種客觀賦權(quán)法，對正交試驗數(shù)據(jù)分別進行分析、處理、計算，用所計算得到的權(quán)重進行綜合評分，對評分結(jié)果進行一致性檢驗，結(jié)果表明3 種賦權(quán)法的排名具有較高的一致性。在3 種客觀賦權(quán)法中，熵權(quán)法和標準離差法都是根據(jù)指標變異性的大小來確定權(quán)重，CRITIC法則不僅考慮了變異對于指標的影響，同時還考慮到各指標之間的相關(guān)性、沖突性，因此，CRITIC 法要比熵權(quán)法、標準離差法更加全面，且對于多指標多對象的綜合評價問題，采用CRITIC 法可消除一些相關(guān)性較強的指標的影響，減少指標之間信息熵的重疊，更有利于得到可信的評價結(jié)果[18-19]。因此，最終確定用CRITIC法計算的權(quán)重系數(shù)進行分析，優(yōu)選得到的最佳工藝條件為：提取3次，每次加10倍量水，提取1 h。該條件下，去甲異波爾定質(zhì)量濃度為197.0 μg/mL、芍藥苷質(zhì)量濃度為1.34 mg/mL，固形物質(zhì)量為56.81 g，綜合評分值為98.12，與正交試驗綜合評分值最大值（98.38）接近，表明工藝合理可行。