基于G1-熵權法和正交設計多指標優(yōu)化血脈疏通顆粒的提取工藝

陳雪婷，徐文杰，李潔環(huán)，馮健英，李智勇，張建軍

[廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州510095]

血脈疏通方作為廣東省第二中醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，已在臨床應用達10年之久，用于改善動脈粥樣硬化、斑塊形成及冠心病、心絞痛、肢體麻木、活動不利等，效果顯著[1]。動脈硬化及斑塊形成，多因氣虛血瘀，痰濁瘀血阻滯經(jīng)脈，導致血脈不通，為本虛標實之證。治療當以補氣活血、化痰通脈，標本兼治。血脈疏通方由黃芪、陳皮、黨參等十味中藥組成，全方共湊補氣化痰、消瘀通脈之功。原湯劑內服，存在攜帶、服用、保存不便的問題，為更好的滿足現(xiàn)代人的用藥需求，提高病人順應性，現(xiàn)擬將其制備為顆粒劑。

G1 法是對層次分析法（AHP）進行改進的一種主觀賦權法，具有計算速度快、無需一致性檢驗等優(yōu)點，而熵權法則是一種客觀賦權法，根據(jù)各指標的變異程度，利用信息熵計算出各指標的熵權，再通過熵權對各指標的權重進行修正，從而得到較為客觀的指標權重[2-4]。本試驗以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷以及固形物質量為評價指標，采用G1-熵權法對各評價指標進行權重系數(shù)分配，將主觀與客觀賦權相結合，優(yōu)選血脈疏通顆粒的最佳提取工藝，以提高試驗結果的科學性與嚴謹性，為后續(xù)該制劑的開發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2998PDA 高效液相色譜儀、Em‐power?3 工作站（美國Waters 公司），Mettler-Toledo XS205DU電子分析天平［梅特勒托利多（中國）有限公司］，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司），DHG-9035A 型鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料

該復方所用中藥飲片購于廣州眾力醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院李智勇主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2020年版一部各品種項下有關要求。

橙皮苷（批號110721-202019，純度95.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201505，純度97.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xbridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，15%B；15～25 min，15～22%B）；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.2 mL/min。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含橙皮苷279.8 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷23.4 μg的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取飲片195 g，提取2 次，每次加入8 倍量水，提取2 h，濾過，合并濾液，濾液濃縮至250 mL。

精密量取濃縮液5 mL置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流4 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例稱取除黃芪、陳皮外的8味飲片，按“2.1.3”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.5 專屬性試驗 將上述對照品、供試品、陰性對照溶液按“2.2.1”項下色譜條件分別注入高效液相色譜儀，結果見圖1?？梢?，陰性對照溶液色譜圖中橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷相應位置無吸收峰，表明陰性無干擾，專屬性良好。

圖1 專屬性試驗HPLC圖Figure 1 HPLC chromatogram for specificity test

2.1.6 線性關系考察 精密量取上述混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 至1 mL 量瓶中，加甲醇至刻度即制成每1 mL 分別含橙皮苷27.98、55.96、111.92、167.88、223.84 μg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.34、4.68、9.36、14.04、18.72 μg 的混合對照品溶液，再分別精密量取10 μL 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X），得橙皮苷回歸方程為Y=3.93×102X-7.32×104，R=0.999 6，毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為Y=5.23×103X-4.64×103，R=0.999 7，說明橙皮苷在279.8～2238.4 ng、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在23.4～187.2 ng之間線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 取同一混合對照品溶液（橙皮苷111.92 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷9.36 μg/mL），按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣測定，重復進樣6 次，記錄峰面積并計算RSD 值，結果顯示橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的RSD 值分別為0.24%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算RSD 值。結果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD 值分別為0.33%、0.28%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，再分別進樣測定，記錄峰面積并計算RSD值，結果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量RSD 值分別為1.45%、1.27%，表明方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取同一批已測定指標成分含量的血脈疏通方濃縮液，精密量取6 份，每份2.5 mL，再精密加入橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量置具塞錐形瓶中，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。再按“2.1.1”項下色譜條件進行檢測，結果橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率分別為98.52%、103.27%，RSD 分別為1.62%、1.85%，加樣回收率符合要求，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果Table 1 Results of sample recovery test（n=6）

2.2 評價指標綜合賦權

2.2.1 G1 法主觀賦權[1-5]G1 法是對AHP 法進行改進的一種計算速度快、無需一致性檢驗的主觀評價方法，首先確定評級指標序的關系，記為y1>y2>…>ym；其次，確定相鄰指標重要程度之比（rk），rk賦值見表2；確定了rk的理性賦值后，通過以下公式計算權重系數(shù)（wk）：

表2 rk賦值參考表Table 2 rk assignment reference table

式中：k=m，m-1……，2。

根據(jù)血脈疏通方君臣佐使的配伍原則，及有效成分的藥理作用，將3 個指標關系設定為毛蕊異黃酮葡萄糖苷（y1）>橙皮苷（y2）>固形物質量（y3），確定r2=1.3，r3=1.2，即毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度、橙皮苷質量濃度、固形物質量主觀權重系數(shù)分別為0.414 9、0.319 1、0.266 0。

2.2.2 熵權法客觀賦權[5-10]熵是系統(tǒng)無序程度的度量，通過熵值來判斷指標的變異程度，變異程度越大，則包含的信息量越多，其對應的權重也應該越高，具體步驟如下：

①建立原始矩陣。設m個評價指標、n個評價對象，形成原始數(shù)據(jù)矩陣（Xij）mn。Xij表示第i次實驗時第j個評價指標的取值。

②將原始矩陣轉換為概率矩陣（Pij）mn。

③計算指標熵值（Hi）。

④計算指標權重系數(shù)（Wi）。

計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物質量客觀權重系數(shù)分別為0.256 3、0.553 8、0.189 9。

2.2.3 組合權重的確定（Wj） G1 法確定主觀權重為W1，熵權法確定的客觀權重為W2，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物質量組合權重系數(shù)分別為0.318 8、0.529 8、0.151 4。公式如下：

式中：Wj為第j個指標的綜合權重；W1j為第j個指標的主觀權重；W2j為第j個指標的客觀權重；m為評價指標個數(shù)。

2.3 血脈疏通顆粒提取工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗設計 以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、加水量（C）為主要考察因素，以橙皮苷質量濃度和毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度及固形物質量為評價指標，采用L9（34）正交設計優(yōu)選血脈疏通顆粒的水提工藝，試驗設計見表3。

表3 因素與水平Table 3 Factors and levels

2.3.2 固形物質量的測定 精密吸取各樣品濃縮液25 mL，置已恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，照2020年版《中國藥典》四部“干燥失重測定法”測定，計算固形物質量，公式如下：

固形物質量=（W×V）/25，

式中：W為25 mL 濃縮液中干固形物質量，V為定容體積。

2.3.3 正交試驗結果分析 按處方比例稱取飲片9份，每份195 g，按正交試驗因素水平設計表對血脈疏通顆粒提取工藝進行優(yōu)化，提取液按“2.1.1”項下色譜條件進樣計算橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量及固形物質量，結合“2.2.3”項下的組合權重，進行綜合評分，結果見表4、表5。由方差分析結果可知，影響提取效果的因素順序為提取次數(shù)>加水量>提取時間，其中提取次數(shù)對試驗結果有顯著影響（P<0.05），確定最優(yōu)提取工藝為：A3B1C1，即提取3次，每次加6倍量水，提取1 h。

表4 正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal experimental design and results

表5 方差分析結果Table 5 Analysis of variance results

2.4 驗證試驗

稱取飲片3份，按上述優(yōu)選工藝提取，再分別測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷含量及固形物質量，結果顯示，3 批平行試驗綜合評分平均值為99.25，RSD 為0.93%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定性良好。結果見表6。

表6 驗證試驗結果Table 6 Validation test results

3 討論

血脈疏通顆粒對氣虛痰瘀型頸動脈硬化及斑塊形成患者的臨床療效顯著，受到廣泛認可，全方由黃芪、陳皮、黨參等10 味飲片組成。文獻研究顯示，本處方藥材同功能主治及現(xiàn)代藥理作用相關的主要有效成分主要存在于水提取液中，包括皂苷類化合物、黃酮類化合物、氨基酸等[11-12]，結合本處方在臨床運用中一直以湯劑入藥有效的現(xiàn)狀以及生產(chǎn)設備條件，確定提取工藝是全方采用水煎煮提取。

中藥復方制劑起效成分復雜多樣，采用多指標優(yōu)化顯然更符合現(xiàn)代制劑的需求，考慮到毛蕊異黃酮葡萄糖苷是君藥黃芪的主要有效成分，可以通過調節(jié)NO/cav-1/MMPs 通路，保護腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的完整性[13-14]；橙皮苷作為臣藥陳皮的主要有效成分，能夠促進巨噬細胞極化，從而抑制高脂飲食誘導的ApoE-1-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展[15]；固形物質量則直接影響到制劑的成型性能，也是藥效的物質基礎。因此，本試驗選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度、橙皮苷質量濃度、固形物質量作為評價指標，使優(yōu)選的提取工藝更符合中藥復方制劑多成分、多靶點的治療體系。

在多指標綜合評價中，權重的確定極為重要，本試驗采用G1-熵權法主客觀組合賦權，同時兼顧了試驗者的主觀性與待評價對象的客觀內在聯(lián)系，使得血脈疏通顆粒提取工藝多指標評價結果更加科學嚴謹。