超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法同時測定舒眠膠囊（片）中4種黃曲霉毒素含量

陳 莉

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350000）

舒眠膠囊（片）由酸棗仁、柴胡、白芍、合歡花、合歡皮、僵蠶、蟬蛻、燈心草等8味藥材組方，用于治療肝郁傷神所致失眠癥［1］。根據(jù)2020年版《中國藥典（四部）》規(guī)定的僵蠶、酸棗仁等25個中藥品種的黃曲霉毒素（AF）檢查項和“中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則”［2］，應(yīng)多加關(guān)注處方中含有易污染藥材中成藥品種的AF污染問題，目前，尚無有關(guān)舒眠膠囊（片）中AF的研究。AF屬真菌毒素曲霉屬，是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類劇毒次級代謝產(chǎn)物［3-4］，以AFB1，AFB2，AFG1，AFG2較常見［5-6］。中藥材和飲片在生產(chǎn)工藝和儲存運輸過程中，易受基質(zhì)、濕度、溫度等因素影響，有可能發(fā)生霉變而產(chǎn)生AF污染，繼而對人體健康產(chǎn)生危害。本研究中建立了同時測定舒眠膠囊（片）中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-QQQ/MS）法，并對3家生產(chǎn)企業(yè)的舒眠膠囊和舒眠片樣品進(jìn)行檢測，為評價制劑安全性提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent G7120A-G6460C型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括G7120A型二元梯度泵，G7167B型自動進(jìn)樣器，G7116B型柱溫箱，MassHunter Workstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；MS105DU/A型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；KQ-500DBG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；TGL-20M型高速臺式離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；PriboFast IAC型免疫親和柱（青島普瑞邦生物科技有限公司，規(guī)格為3 mL）。

1.2 試藥

舒眠膠囊（貴州大隆有限責(zé)任公司，批號分別為20210511、20210906、20211028、20211115、20211224、20220109，規(guī)格為每粒0.4 g）；舒眠片（無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，批號分別為210923、211107、211212，北京長城制藥廠，批號分別為20210607、20211123、20211218，規(guī)格均為每片0.48 g）；AF對照溶液（中國食品藥品檢定研究院，批號為610011-202104，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2標(biāo)示質(zhì)量濃度分別為0.93，0.33，1.02，0.35 μg/mL）；乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為AgilentZORBAXEclipsePlusC18柱（150 mm×2.1mm，2.6 μm）；流動相為9.0 mmol/L乙酸銨溶液（A）-甲醇-乙腈（1∶1，V/V，B），梯度洗脫（0～4.5 min時68%A→12%A，4.5～6 min時12%A→1%A，6～6.5 min，1%A→68%A，6.5～10 min時68%A）［7-8］；流速為0.3 mL/min；柱溫為28℃；進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件［9-10］：電離方式為電噴霧離子源（ESI+）；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），分析參數(shù)見表1；霧化氣流速為7.5 L/min，溫度為400℃；毛細(xì)管電壓為0.6 kV；離子源溫度為200℃。

表1 黃曲霉毒素質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrum parameters of aflatoxin

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：精密吸取AF對照溶液2 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2質(zhì)量濃度分別為18.6，

6.6，20.4，7.0 ng/mL）。

供試品溶液：取樣品或樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉5 g、正己烷100 mL［11］，30 000 r/min攪拌3 min，濾過，濾渣揮干，精密加入85%甲醇50 mL，5 000 r/min離心5 min，精密量取上清液20 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 mL，過免疫親和柱（25℃），流速為3 mL/min，加水10 mL洗脫，棄去洗脫液，使空氣入柱，擠出水，再加甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL容量瓶中，并加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

加標(biāo)供試品溶液：取預(yù)試驗中未檢出AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，且與制備供試品溶液所用同一批樣品，及系列混合對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制得加標(biāo)供試品溶液。

空白對照溶液：不取樣品，按供試品溶液制備方法制得空白對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、加標(biāo)供試品溶液及空白對照溶液各適量，按2.1項下試驗條件下進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果空白對照無干擾，詳見圖1。

圖1 總離子流圖1.AFG2 2.AFG1 3.AFB2 4.AFB1A.Mixed reference solution B.Test solution C.Spiked test solution D.Blank reference solutionFig.1 Total ion chromatograms

線性關(guān)系考察：取2.2項下混合對照品溶液適量，加70%甲醇逐級稀釋成AFB1，AFB2，AFG1，AFG2質(zhì)量濃度分別為0.186，0.744，1.488，7.440，18.600 ng/mL；0.066，0.264，0.528，2.640，6.600 ng/mL；0.204，0.816，1.622，8.160，20.400 ng/mL；0.070，0.280，0.560，2.800，7.000 ng/mL的系列混合對照品溶液。按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

檢測限與定量限考察：取混合對照品溶液適量，逐級稀釋，以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時各待測成分的質(zhì)量濃度為檢測限和定量限。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系、檢測限、定量限考察結(jié)果Tab.2 Results of linear relation test，limit of detection and limit of quantification

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液2 μL，按2.1項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄離子強(qiáng)度。結(jié)果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2峰面積的RSD分別為0.95%、1.33%、1.26%、1.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取2.2項下加標(biāo)供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，3，6，9，12，15，18 h時按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子強(qiáng)度。結(jié)果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2峰 面 積 的RSD分 別 為1.47%，1.92%，1.65%，1.78%（n=7），表明加標(biāo)供試品溶液室溫下放著18 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品或樣品內(nèi)容物適量，按2.2項下方法制備加標(biāo)供試品溶液，共6份，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子強(qiáng)度并計算含量。結(jié)果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的平均值分別為0.990 6，0.332 8，0.972 4，0.335 4 ng，RSD分別為1.85%，1.93%，2.06%，2.11%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

回收試驗：取未檢出AF的樣品（批號為20211115，211107）約1.5 g，共9份，分別精密加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各1.0 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子強(qiáng)度并計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 舒眠膠囊回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取樣品或樣品內(nèi)容物適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件下進(jìn)樣測定，記錄離子強(qiáng)度。結(jié)果12批樣品中均未檢出AF。

3 討論

目前測定中藥中AF的方法主要有高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法、高效液相色譜-柱后碘衍生熒光檢測法、酶聯(lián)免疫層析法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等［8，12-14］。舒眠膠囊（片）成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾大，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的MRM具有較高的靈敏度和專屬性，可減少其衍生誤差，排除基質(zhì)干擾，避免假陽性結(jié)果。本研究中采用的UPLC-QQQ/MS法檢測AF分析周期僅10 min，顯著縮短了分析時間，減少了溶劑消耗，相比于高效液相色譜（HPLC）法具有更高的分析效率和更佳的峰容量。

預(yù)試驗中對4種AF的母離子進(jìn)行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種AF在正離子模式下的響應(yīng)值較高，然后通過儀器自動優(yōu)化最佳的毛細(xì)管電壓和碰撞能量，選取響應(yīng)值高且穩(wěn)定的2個子離子作為定性和定量離子；并依次考察了流動相系統(tǒng)（甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨、甲醇-甲酸、甲醇-乙腈-乙酸銨），柱溫（25℃、28℃、30℃），進(jìn)樣量（1 μL、2 μL、5 μL），不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇提取溶劑（75%、85%、90%），過免疫親和柱的流速（1mL/min、3mL/min、5 mL/min），過免疫親和柱的溫度（10℃、25℃、30℃、35℃），最終確定了正式試驗條件及供試品溶液提取方法；同時發(fā)現(xiàn)柱溫對測定結(jié)果影響不大，供試品溶液制備過程中免疫親和柱上酶的活性與室內(nèi)溫度有關(guān)，免疫親和柱中抗體與樣品中抗原反應(yīng)的時間也會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

依據(jù)2020年版《中國藥典》對需進(jìn)行AF檢測的品種規(guī)定限量，AFG1，AFG2，AFB1，AFB2總量的最大限量不得超過5 μg/kg及10 μg/kg，本研究中12批樣品中均檢測出上述4種成分，符合藥典規(guī)定。分析原因可能是與藥品制備方法相關(guān)，舒眠膠囊（片）處方中是以僵蠶、蟬蛻及酸棗仁提取物入藥，及企業(yè)對中成藥生產(chǎn)工藝及中成藥存放條件控制較嚴(yán)。

綜上所述，本研究中建立了同時測定舒眠膠囊（片）中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的UPLC-QQQ/MS法，該法檢測速度快且滿足方法學(xué)驗證各項指標(biāo)，可作為檢查該制劑中AF的依據(jù)，同時可為檢查含僵蠶、蟬蛻及酸棗仁的中成藥中的AF提供一定參考。試驗結(jié)果顯示，制劑在AF方面相對較安全，但若在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加AF檢查項，還需進(jìn)一步研究制劑中AF的限度。