銀翹解毒口服液中山銀花鑒別方法研究*

朱澤兵，何世新

（重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所·三峽庫(kù)區(qū)道地藥材開(kāi)發(fā)利用重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404100）

銀翹解毒口服液，由金銀花、連翹、薄荷等9種中藥材組方，有辛涼解表、清熱解毒等功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒、發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等［1-4］。2000年版《中國(guó)藥典（一部）》將忍冬Lonicera japonicaThunb.，灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬Lonicera confusaDC.，黃褐毛忍冬Lonicera fulvotmentosaHsu et S.C.Chen）共同歸屬于金銀花，但2005年版《中國(guó)藥典》及以后版本將忍冬歸屬為金銀花，其余4種忍冬均歸屬山銀花［5-6］。銀翹解毒顆粒中金銀花的投料不合格率較高［7］，使用山銀花代替金銀花仍是較普遍現(xiàn)象，鑒別關(guān)鍵是找出兩種藥材中的特征性標(biāo)志物質(zhì)，即灰氈毛忍冬皂苷乙［8-10］。此外，2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中銀黃類制劑中山銀花的鑒別均以灰氈毛忍冬皂苷乙為特征性成分［11］。為此，本研究中以灰氈毛忍冬皂苷乙為特征性成分，采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法對(duì)銀翹解毒口服液中的金銀花及山銀花進(jìn)行了鑒別，并與現(xiàn)行高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法進(jìn)行比較?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；QE Focus型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；SDLA-B-1101型超純水機(jī)（重慶圣德利醫(yī)療器械研究有限公司）；AB204S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為萬(wàn)分之一）；MSE225S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

29批銀翹解毒口服液購(gòu)自不同省市的不同藥店，涉及全國(guó)22家生產(chǎn)企業(yè)，規(guī)格為每支10 mL（樣品來(lái)源與批號(hào)見(jiàn)表1）；灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111814-201604，含量94.4%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。金銀花和山銀花藥材均經(jīng)重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所郭婭中藥師鑒定為正品。

表1 樣品來(lái)源與批號(hào)Tab.1 Source and batch numbers of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Thermo C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B，含5.0 mmol/L乙酸銨），梯度洗脫（0～2 min時(shí)10%A，2～4.5 min時(shí)10%A→90%A，4.5～6 min時(shí)90%A，6～6.01 min時(shí)90%A→10%A，6.01～8 min時(shí)，10%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），正離子模式，電離電壓（IS）為3.2 kV，鞘氣流速為30 mL/min，輔助氣流速為10 mL/min，離子化溫度（TEM）為350℃。灰氈毛忍冬皂苷乙的定性離子對(duì)m/z1 421.7/1 097.6，碰撞能量1（CE1）為107 eV，定量離子對(duì)為m/z1 421.7/493.1，碰撞能量2（CE2）為121 eV，去簇電壓（DP）為250 V。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含灰氈毛忍冬皂苷乙0.7 mg的對(duì)照品溶液。

對(duì)照藥材溶液：分別取金銀花藥材和山銀花藥材，按2020年版《中國(guó)藥典》金銀花處理方法處理，制得單一對(duì)照藥材溶液。

供試品溶液：取樣品2 mL，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按銀翹解毒口服液處方和工藝制備缺金銀花及山銀花的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，陰性對(duì)照品溶液色譜在與灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相同處無(wú)干擾峰，表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)譜圖1.Macranthoidin BA.Reference solution B.Reference material solution of Lonicerae Flos C.Reference material solution of Lonicerae Japonicae Flos D.Test solutionE.Negative reference solutionFig.1 Mass spectrograms

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇溶液稀釋制成質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200 ng/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取5 μL，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以灰氈毛忍冬皂苷質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)、峰面積對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y=1 805.210 03X+823.135 72（r=0.999 90）。結(jié)果表明，毛氈忍冬皂苷質(zhì)量濃度在5.299 86～211.994 29 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限考察：精密吸取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度分別記作檢測(cè)限和定量限。結(jié)果分別為1.50 ng/mL及5.0 ng/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄離子豐度。結(jié)果的RSD為0.93%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，3，6，9，12，24，36，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度。結(jié)果的RSD為3.47%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度并計(jì)算含量。結(jié)果毛氈忍冬皂苷含量為每片2.31 mg，RSD為1.70%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品（編號(hào)為S1）適量，加入對(duì)照品溶液3 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為93.66%，RSD為2.41%（n=6）。

2.4 樣品含量測(cè)定

取29批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，均取2份。并按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子豐度，計(jì)算樣品含量，并與HPLC-ELSD法比較，結(jié)果見(jiàn)表2 。HPLC-ELSD法及HPLC-MS法分別檢測(cè)出5批次及7批次不符合規(guī)定的樣品。且2種方法測(cè)定結(jié)果的RSD≤2.5%，表明2種方法均具有較好的兼容性，均可用于銀翹解毒口服液中山銀花投料的鑒別，后者標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格。

3 討論

目前，金銀花制劑中山銀花的鑒別主要均是以灰氈毛忍冬皂苷乙為特征性物質(zhì)，采用薄層色譜法和HPLC-ELSD法進(jìn)行鑒別［11-15］。陸靜嫻等［7］以灰氈毛忍冬皂苷乙為特征性物質(zhì)，采用HPLC-ELSD法測(cè)定了189批次銀翹解毒顆粒，其中有22批次樣品僅達(dá)到檢測(cè)限而未達(dá)到定量限但判定為符合規(guī)定，表明HPLCELSD法在測(cè)定金銀花中藥制劑中的灰氈毛忍冬皂苷乙含量時(shí)，其檢測(cè)靈敏度與目標(biāo)值還有一定差距。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定，山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙總含量不得低于5.0%［12］，以山銀花中可允許的灰氈毛忍冬皂苷乙的最低限量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，當(dāng)每1 mL銀翹解毒口服液中山銀花含量為0.15×10-6時(shí)，就能被檢測(cè)到，靈敏度較高。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，HPLC-MS法的線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率均良好，測(cè)定樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的結(jié)果真實(shí)可靠，重復(fù)性好，可用于銀翹解毒口服液中山銀花投料的鑒別。與HPLCELSD法檢測(cè)結(jié)果比較，HPLC-MS法抽檢樣品不合格率更高，即后者鑒別能力更強(qiáng)，標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格。24.14%的不合格率表明部分企業(yè)仍以山銀花替代金銀花生產(chǎn)銀翹解毒口服液。針對(duì)這些問(wèn)題，應(yīng)不斷提升銀翹解毒口服液中山銀花的鑒定技術(shù)，加強(qiáng)銀翹解毒口服液中山銀花投料的監(jiān)管。