鉤吻氧化單萜吲哚生物堿及其抗真菌活性研究*

梁嘉俊，蒲 翔，赫 衛(wèi)，潘 倩，周永強(qiáng)，周 英，魏 鑫

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

馬錢科(Loganiaceae)鉤吻屬(Gelsemium)植物鉤吻(Gelsemiumelegans)最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，又名胡蔓藤，斷腸草、大茶藥[1-2]，為著名毒性中藥，在我國南方鉤吻廣泛分布在福建，云南，貴州，廣東，廣西等地[3]。作為傳統(tǒng)中藥，鉤吻在民間以外用為主，具有祛風(fēng)、殺蟲止癢、消腫拔毒的功效[4]，在一些少數(shù)民族地區(qū)，鉤吻常用于治療跌打損傷，骨折等骨關(guān)節(jié)疾病[5-6]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鉤吻富含單萜吲哚生物堿類成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜，抗焦慮，抗腫瘤，抑菌等活性[7-11]。前期鉤吻的中藥化學(xué)研究大部分集中于其根莖部位，并且發(fā)現(xiàn)一些具有良好抗菌活性生物堿類成分[12]，而針對(duì)鉤吻地上部分生物堿類成分研究報(bào)道相對(duì)較少。本文采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術(shù)對(duì)于鉤吻地上部位總生物堿進(jìn)行了分離純化，結(jié)合核磁共振波譜(NMR)以及質(zhì)譜(MS)等結(jié)構(gòu)鑒定手段確定了所得單體成分結(jié)構(gòu)，分離得到5個(gè)鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿，分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1)，14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2)，gelsedilam(3)，Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5)(圖1)，并對(duì)鉤吻總生物堿提取物以及化合物1和3的抗真菌的活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL的濃度下鉤吻總生物堿提取物對(duì)辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)菌絲生長抑制率為34.80 %。

圖1 化合物1-5的結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 核磁共振共振儀(AVANCE NEO 400 MHz)購買自德國Bruker公司，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵購買自鄭州長城科工貿(mào)易有限公司，DL-400循環(huán)冷卻器(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)，SB-600DTY超聲波多頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，F(xiàn)A2104N電子天平購買自上海菁海儀器有限公司，半制備高效液相色譜儀(LC-52)購置于Separation(Beijing)科技公司，GF254硅膠板、柱層析硅膠(200-300目和80-100目)均購買于青島海洋化工有限公司，MCI(GEL-CHP 20P)(Mitsubishi Chemical Co.，Ltd.Japan)，Rp-18半制備柱(250 mm×10 mm，5μm)購買于賽譜銳思(北京)科技有限公司；恒溫暗培箱購買自常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；DMSO購買自北京索萊寶科技有限公司；二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮均為分析純購買于天津市富宇精細(xì)化工有限公司。鉤吻藥材地上部位于2021年4月購自云南眾和植域生物科技有限公司，經(jīng)昆明植分生物技術(shù)有限公司鑒定師婁安瑞鑒定為馬錢科鉤吻屬鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn.et Champ.)Benth.，標(biāo)本保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本號(hào)為WX_20210401。

1.2 提取與分離 干燥鉤吻地上部分 20 kg，用乙醇浸提三次，回流提取兩次，每次 2 小時(shí)，合并提取液并減壓回收乙醇得浸膏 3893 g，加適量水溶解，然后加入稀鹽酸酸化至PH=2，放置過夜，過濾，濾液用氨水調(diào)堿性至PH=10，二氯甲烷萃取，得浸膏221 g，萃取后浸膏硅膠(80-100目)拌樣，利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷-甲醇體系(v/v 100% → 0%)梯度洗脫，通過薄層色譜分析得 25個(gè)組分，分別為 L-1至L-25。

L-5和L-6合并后利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷-乙酸乙酯(v/v 2∶1 → 1∶4)，后經(jīng)MCI柱色譜(甲醇-水v/v 40% → 100%)梯度洗脫后得分段GL-1至10，GL-7進(jìn)行MCI、ODS，硅膠柱色譜洗脫，最后利用制備型 HPLC(乙腈-水v/v 20% → 60%)40 min梯度洗脫，得化合物1(6 mg)和化合物3(5 mg)，MCI 柱色譜洗脫后及GL-5剩余樣品合并得分段GL-6，進(jìn)行 MCI，硅膠柱色譜，ODS柱色譜洗脫，梯度洗脫，最后分別利用制備型 HPLC(乙腈-水=30% → 100%)40 min梯度洗脫，得化合物2(5mg)；(乙腈-水=30% → 100%)30min梯度洗脫得化合物4(10 mg)；(乙腈-水=40% → 80%)30 min 梯度洗脫得化合物5(38 mg).

1.3 抗真菌活性評(píng)價(jià)和菌絲生長抑制率測定 將在室溫保存的辣椒疫霉菌菌種接種在燕麥固體培養(yǎng)基(OMA培養(yǎng)基)上進(jìn)行培養(yǎng)，在25 ℃-28 ℃ 下恒溫暗培養(yǎng)3天至對(duì)照白色菌絲充分生長繁殖布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面。取提取物0.5 mg(20 μL DMSO稀釋)，燕麥培養(yǎng)基 5 mL，加入到6 cm培養(yǎng)皿中混勻，對(duì)照加入20 μL DMSO。用Φ 0.8 cm打孔器在新鮮菌平板打菌餅，取1個(gè)菌餅倒置培養(yǎng)基平板中央，培養(yǎng)3天，每天采用“十”字交叉法測量菌落大小，計(jì)算菌絲生長抑制率。

菌落直徑(cm)=測量直徑-0.8 cm

菌絲生長抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對(duì)照菌落直徑×100 %

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1C19H20N2O4，1H NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ 2.58(3H，s，H-18)，3.42(1H，t，J=9.2 Hz，H-16)，3.70(1H，dd，J=4.3，2.5 Hz，H-3)，3.90(3H，s，Na-OMe)，4.32(2H，m，H-17)，6.96(1H，d，J=7.7 Hz，H-12)，7.11(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.31(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.57(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(150 MHz，Methanol-d4)δ 26.2(C-18)，28.6(C-14)，38.9(C-6)，40.5(C-15)，40.5(C-16)，57.8(C-7)，62.4(C-17)，63.9(Na-OMe)，75.6(C-5)，76.4(C-3)，107.9(C-12)，124.7(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，133.2(C-8)，139.1(C-13)，173.0(C-2)，179.7(C-20)，198.4(C-19).數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[13]相符。

2.1.2 化合物2C19H20N2O5，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 2.57(3H，s，H-18)，3.91(3H，s，Na-OMe)，4.72(1H，m，J=7.6，4.9，2.4 Hz，H-5)，6.96(1H，d，J=7.6 Hz，H-12)，7.13(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.59(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(100 MHz，Methanol-d4)δ 26.1(C-18)，38.6(C-6)，39.4(C-16)，49.9(C-15)，55.9(C-7)，61.9(C-17)，64.0(Na-OMe)，67.2(C-14)，75.2(C-5)，80.4(C-3)，108.0(C-12)，124.9(C-10)，125.8(C-9)，129.6(C-11)，133.0(C-8)，139.0(C-13)，172.8(C-2)，176.5(C-20)，198.3(C-19).數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[14]相符。

2.1.3 化合物3C17H18N2O4，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 3.74(1H，dd，J=4.9，2.0 Hz，H-3)，3.95(3H，s，Na-OMe)，4.12(1H，m，H-5)，4.24(1H，m，H-17)，6.98(1H，dd，J=7.7，1.1 Hz，H-12)，7.11(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.8，1.2 Hz，H-11)，7.54(1H，dd，J=7.6，1.2 Hz，H-9).13C NMR(101 MHz，Methanol-d4)δ 27.8(C-14)，37.5(C-16)，37.7(C-6)，38.1(C-15)，57.2(C-7)，58.5(C-5)，62.6(C-17)，64.0(Na-OMe)，76.0(C-3)，108.0(C-12)，124.6(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，133.1(C-8)，139.4(C-13)，173.2(C-2)，182.7(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[15]相符。

2.1.4 化合物4C18H20N2O4，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 2.84(3H，s，Nb-Me)，3.70(1H，dd，J=5.0，2.0 Hz，H-3)，3.95(3H，s，Na-OMe)，4.04(1H，m，H-5)，6.99(1H，m，H-12)，7.12(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.32(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.54(1H，dd，J=7.5 ，1.1 Hz，H-9).13C NMR(100 MHz，Methanol-d4)δ 27.9(C-14)，28.4(Nb-Me)，33.3(C-6)，36.5(C-16)，38.1(C-15)，57.3(C-7)，62.5(C-17)，64.0(C-5)，64.6(Na-OMe)，76.3(C-3)，108.1(C-12)，124.6(C-10)，125.8(C-9)，129.5(C-11)，132.9(C-8)，139.4(C-13)，173.0(C-2)，179.3(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[16]相符。

2.1.5 化合物5C19H22N2O5，1H NMR(400 MHz，Methanol-d4)δ 1.09(3H，t，J=7.2 Hz，H-18)，2.23(1H，dd，J=16.0，4.8 Hz，H-6)，3.84(1H，m，H-5)，4.04(3H，s，Na-OMe)，7.09(1H，m，H-12)，7.18(1H，td，J=7.6，1.1 Hz，H-10)，7.38(1H，td，J=7.7，1.2 Hz，H-11)，7.58(1H，dd，J=7.5，1.2 Hz，H-9).13CNMR(100MHz，Methanol-d4)δ7.4(C-18)，30.0(C-19)，35.0C-16)，35.3(C-6)，55.8(C-7)，56.7(C-5)，62.2(C-17)，64.2(Na-OMe)，67.9(C-15)，69.3(C-14)，80.0(C-3)，108.5(C-12)，125.1(C-10)，126.6(C-9)，129.8(C-11)，132.1(C-8)，139.3(C-13)，175.4(C-2)，211.6(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[17]相符。

2.2 抗真菌活性評(píng)價(jià) 通過觀察真菌菌絲的生長情況，對(duì)鉤吻總生物堿以及化合物1和3的抗真菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，與對(duì)照組相比，能夠明顯發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿在100 μg/mL的濃度下辣椒疫霉菌(P.capsici)具有中等的抑制活性，其菌絲生長抑制率為34.80 %，相同濃度下，化合物1和3并沒有顯示抗真菌活性，結(jié)果表明鉤吻總堿部位具有一定的抗真菌活性，提示鉤吻可能在辣椒疫霉菌的防治中具有一定的應(yīng)用前景。

3 小結(jié)

鉤吻是中國著名毒性中藥，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[18]，同時(shí)鉤吻在畜牧養(yǎng)殖業(yè)也具有極高的應(yīng)用價(jià)值，被稱為“豬人參”，可以對(duì)豬、羊等家畜產(chǎn)生促生長作用，極大提高了畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[19]。辣椒疫霉菌是一種植物真菌，可引起辣椒疫病，是在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的毀滅性土傳病害[20]，其在土壤中可長期存在，同時(shí)可在受侵染的病殘?bào)w中存活，寄主范圍廣[21]。前期鉤吻的中藥化學(xué)研究大部分集中于其根莖部位，針對(duì)鉤吻地上部分生物堿類成分研究報(bào)道相對(duì)較少。采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術(shù)對(duì)鉤吻地上部位總生物堿進(jìn)行了分離純化，結(jié)合核磁共振波譜(NMR)以及質(zhì)譜(MS)等結(jié)構(gòu)鑒定手段確定了所得單體成分結(jié)構(gòu)，并且檢測了化合物1和化合物3及總生物堿提取物的抗辣椒疫霉菌活性，共分離得到5個(gè)鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿，分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1)，14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2)，gelsedilam(3)，Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5)，抗菌活性測試發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿提取物(100 μg/mL)對(duì)辣椒疫霉菌菌絲生長抑制率為34.80%，該研究為豐富鉤吻氧化單體吲哚生物堿的結(jié)構(gòu)類群提供支撐和有益借鑒，為進(jìn)一步的鉤吻生物堿藥理學(xué)篩選提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)為辣椒疫霉菌的防治提供參考。