C-erbB-2在不同劑量丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍治療OSF前后的表達變化研究

張國富，楊 帆，鄭 玥，肖雙霜

（湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，湖北 宜昌 443000）

近年來，人們對口腔疾病的重視度越來越高，但由于人們進食的食物存在多樣化，且攝入的高鹽、高脂及煎炸食物較多，因此導(dǎo)致口腔疾病的發(fā)病率逐年升高，尤其是年輕人的患病率更高。口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis，OSF）是一種慢性口腔疾病，可侵犯口腔的任何部位。在患病早期，患者可能表現(xiàn)為無癥狀，隨著病情的發(fā)展會出現(xiàn)口腔內(nèi)燒灼感，尤其在進食刺激性食物時表現(xiàn)更為明顯，后期可出現(xiàn)吞咽困難、口腔黏膜變白、出現(xiàn)纖維條索等表現(xiàn)[1]。OSF 屬于口腔癌癌前病變，病因復(fù)雜，其發(fā)生與多種癌基因相互作用有關(guān)。本研究擬通過對OSF 組織進行檢測，觀察C-erbB-2 在各組標本中表達的差異性來探討運用丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍治療OSF 的精確劑量，以達到最佳的臨床效果?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

隨機選取2019 年3 月至2021 年5 月間在我院口腔科、宜昌市中心醫(yī)院口腔科，宜昌市第一人民醫(yī)院口腔科進行治療的69 例OSF 患者作為研究對象，其治療方案均為丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍，根據(jù)用藥劑量的不同將其分為小劑量組（A 組）、中劑量組（B 組）、高劑量組（C 組），每組各23 例。隨機選取同時期我院收治的10 例口腔黏膜正常患者作為對照。病例納入標準：OSF 患者的病情經(jīng)臨床檢查得到確診；入組前未接受過相關(guān)治療；病理資料齊全；自愿參與本研究。在69 例OSF 患者中，有男性36 例，女性33 例；其年齡為26 ～67 歲。在10 例口腔黏膜正?；颊咧?，有男性5 例，女性5 例；其年齡為22 ～56 歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 C-erbB-2 單克隆抗體（克隆系CBll）及SP 試劑盒，均購自上海博英生物有限公司；二步法檢測試劑盒、即用型SABC 試劑盒、酶底物DAB 顯色劑，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 檢測方法 免疫組化二步法（S-P）：取新鮮的口腔黏膜組織（包括OSF 組織與正常口腔黏膜組織），使用甲醛進行固定，甲醛濃度為4%。固定后用石蠟包埋，然后制備成5 μm 的切片，并對切片進行免疫組化染色，具體步驟：1）對制備好的載玻片進行去污處理，即使用濃硫酸重鉻酸鉀洗液浸泡。浸泡24 h 后進行防脫片處理，即浸泡在多聚賴氨酸稀釋液中24 h。處理后放在干燥箱中烘烤50 min。2）使用烤片機對載玻片進行烘烤，烘烤溫度為60℃，烘烤時間為4 h。3）置入100% 的二甲苯、95% 和80% 的酒精內(nèi)進行脫蠟、水化處理。4）置入雙氧水（3%）中浸泡10 min 后，使用PBS 緩沖液進行沖洗，每次沖洗時間均為3 min，連續(xù)沖洗3 次。5）進行抗原熱修復(fù)：將載玻片浸泡于盛有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中進行加熱，保持水沸騰狀態(tài)2 min，之后放置于室溫下進行冷卻。6）添加一抗，工作液為p53 和Bcl-2，在冰箱內(nèi)孵育過夜，冰箱內(nèi)溫度為4℃恒溫，然后使用PBS緩沖液連續(xù)沖洗3 次，每次沖洗時間均為5 min。7）添加試劑1，在室溫下孵育20 min，再使用PBS 緩沖液沖洗3 次，每次沖洗時間均為3 min。8）添加試劑2，在室溫下進行孵育，時間為30 min，再次使用PBS緩沖液沖洗3 次，每次沖洗時間均為3 min。9）進行DAB 顯色：在室溫環(huán)境下進行反應(yīng)，經(jīng)鏡下控制反應(yīng)時間，最后以自來水沖洗結(jié)束反應(yīng)。10）使用蘇木素復(fù)染，使細胞核著色、脫水，最后應(yīng)用透明、中性樹脂封片。

1.2.3 結(jié)果判讀 C-erbB-2 蛋白大部分表達于細胞漿內(nèi)，顏色為棕黃色顆粒。在高倍鏡下對檢測結(jié)果進行判讀，具體判讀方法參考Campo 等[2]制定的標準：0 分：基本不著色；1 分：弱著色；2 分：中度著色；3 分：強著色。陽性細胞數(shù)所占比例共計分為四個評分等級：0 分：0% ～5% ；1 分：6% ～25% ；2 分：26% ～50% ；3 分：50% 以上。最后判讀結(jié)果= 陽性細胞所占比例+染色強度分值，0 分：陰性（-）；1 分：弱陽性（+）；2 分：弱陽性（+）；3 分：中等陽性（++）；4 分：中等陽性（++）；5 分及以上：強陽性（+++）。

1.3 觀察指標

觀察C-erbB-2 蛋白在OSF 組織與正常口腔黏膜組織中的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)± 標準差（±s） 表示，組間比較采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

C-erbB-2 蛋白大部分表達于細胞漿內(nèi)，顏色為棕黃色顆粒。C-erbB-2 蛋白陽性細胞主要分布在口腔黏膜組織的上皮基底層；在OSF 組織中的表達為治療劑量越大，其增加程度越??；治療劑量越小，其增加程度越大。C-erbB-2 蛋白在正?？谇火つそM織及C 組、B 組、A 組口腔黏膜組織中的陽性細胞數(shù)呈逐漸增加的趨勢，且分布范圍為逐漸從上皮基底層向表層擴散。見圖1。正?？谇火つそM織中細胞周期蛋白依賴性激酶2 關(guān)聯(lián)蛋白1（CDK2AP1）的平均陽性率為（1.24±2.72）%，OSF 治療組上皮細胞平均陽性率：A 組：（26.71±8.93）% ；B 組：（22.41±5.91）% ；C 組：（18.24±6.43）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 C-erbB-2 蛋白在正?？谇火つそM織及C 組、B 組、A 組口腔黏膜組織中的分布情況

表1 各組細胞C-erbB-2 蛋白的陽性率（%）

3 討論

C-erbB-2 是一種細胞來源癌基因，臨床上對其進行的研究主要集中于基因蛋白產(chǎn)物（P185）的過度表達和擴增方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2 基因的產(chǎn)物是一種細胞膜受體，該蛋白與表皮生長因子受體（EGFR）有高度的同源性，與未知配體結(jié)合后，經(jīng)蛋白激酶活性的刺激，可進一步促進細胞的分裂、增殖和轉(zhuǎn)化。C-erbB-2 的擴增或表達一般見于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌和肺癌等組織中，這證明其參與了某些癌癥的發(fā)生及發(fā)展[4]。正常狀態(tài)下，C-erbB-2均為未激活狀態(tài)，但當機體受到相關(guān)因素影響并出現(xiàn)變化后，其可能被激活，并出現(xiàn)向腫瘤轉(zhuǎn)化的活性。C-erbB-2 的激活過程主要是通過基因擴增來實現(xiàn)的，該基因擴增和腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系[5]。研究認為，C-erbB-2 蛋白產(chǎn)物的免疫組化染色結(jié)果與基因擴增拷貝數(shù)之間呈明顯的正相關(guān)，因此，通過檢測口腔黏膜鱗癌組織中C-erbB-2 蛋白的表達情況，就可以對癌基因的擴增情況進行預(yù)測[6]。在Raha 等[7]研究指出，乳腺癌患者的C-erbB-2 蛋白呈高表達狀態(tài)，且在轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結(jié)中也呈高表達狀態(tài)。Hung 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鼠原癌基因C-erbB-2 在擴增狀態(tài)下，會導(dǎo)致起轉(zhuǎn)膜區(qū)點突變，最后激活了C-erbB-2，因此可認為C-erbB-2 癌基因是通過以上步驟激活的，即擴增和點突變激活。本次研究中，通過對正?？谇火つそM織中C-erbB-2 的表達情況，以及不同劑量丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍治療OSF 前后C-erbB-2 的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)正?？谇火つそM織中細胞CDK2AP1的平均陽性率為（1.24±2.72）%，OSF 治療組上皮細 胞 平 均 陽 性 率：A 組：（26.71±8.93）%；B 組：（22.41±5.91）%； C 組：（18.24±6.43）%。說明C-erbB-2在OSF 組織中的表達明顯高于在正?？谇火つそM織中的表達（P＜0.05）。C-erbB-2 在OSF 患者口腔黏膜組織中的表達情況為：A 組＞B 組＞C 組（P＜0.05）。提示C-erbB-2 在口腔黏膜組織中的表達與病理組織學(xué)分級有關(guān)，組織分化程度越低，C-erbB-2 的陽性表達越高，因此可以初步判斷C-erbB-2 與口腔的惡性病變程度有相關(guān)性。臨床上應(yīng)用丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍治療OSF 的效果較為明顯，且在一定范圍內(nèi)，用藥劑量越大患者的臨床效果越顯著。

綜上所述，C-erbB-2 在口腔黏膜中的表達水平會隨著口腔病變惡性程度的增高而增高，該指標對于運用精確劑量丹參注射液聯(lián)合潑尼松龍治療OSF 以及研究口腔病變惡性程度有一定意義。