預防用mRNA疫苗非臨床安全性研究一般原則及關(guān)注點

陳 波，關(guān)亞娜，郭 偉，顧 輝，朱睿明，呂 琳，扈正桃，岑小波，2

（1.成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041；2.四川大學華西醫(yī)院國家成都新藥安全性評價中心，四川 成都 610041）

信使 RNA（messenger RNA，mRNA）疫苗是將mRNA在體外進行相關(guān)修飾后傳遞至機體細胞內(nèi)表達并產(chǎn)生蛋白抗原，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應的一類新型核酸疫苗。mRNA疫苗的研發(fā)可追溯至1990年，Wolff等［1］將體外轉(zhuǎn)錄的 β-半乳糖苷酶mRNA注射到小鼠骨骼肌，成功檢測到其表達的β-半乳糖苷酶蛋白。此后研究表明，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA可在體內(nèi)編碼相應蛋白并產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫反應［2-4］，提示mRNA具有潛在的治療和（或）預防疾病的效應。但由于mRNA自身序列結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差，免疫應答及自發(fā)跨膜效率低，限制了mRNA疫苗的研發(fā)。近20年，隨著核酸修飾及遞送載體技術(shù)的快速發(fā)展，mRNA疫苗的臨床轉(zhuǎn)化及應用發(fā)展迅速。2021年2月《麻省理工科技評論》發(fā)布的2021年“十大突破性技術(shù)”中，mRNA疫苗位居榜首。迄今，全球有2款mRNA疫苗獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）批準，分別為德國生物新技術(shù)公司（BioNTech）與美國輝瑞公司合作研發(fā)的BNT162b2和美國莫德納（Moderna）公司研發(fā)的mRNA-1273，兩者在全球新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情中表現(xiàn)出從研發(fā)到臨床應用的快速轉(zhuǎn)化能力、良好的人群保護力和安全性。本文從mRNA疫苗基本生物學特征出發(fā)，結(jié)合全球現(xiàn)有的相關(guān)指導原則、非臨床及臨床研究、相關(guān)研究評價資料，重點討論預防用mRNA疫苗在非臨床安全性研究中的一般原則和關(guān)注點，為預防用mRNA疫苗研發(fā)和臨床不良反應監(jiān)測預警提供參考。

1 mRNA疫苗基本生物學特征

1.1 基本生物學信息

mRNA是一類攜帶編碼蛋白質(zhì)合成信息的單鏈核糖核酸。一個經(jīng)典的mRNA應包括5個必要區(qū)域：從5′端至3′端依次是5′端帽（5′Cap）結(jié)構(gòu)、5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）、3′UTR和多聚腺嘌呤核糖核苷酸〔Poly（A）〕序列。5′Cap保證mRNA以正確的方向指導蛋白質(zhì)翻譯，Poly（A）主要增加mRNA的穩(wěn)定性，5′UTR和3′UTR增強mRNA的翻譯效率，ORF是編碼蛋白質(zhì)的密碼子。mRNA疫苗則是基于mRNA編碼蛋白合成的特性，據(jù)特定蛋白抗原的密碼子序列設計ORF，在體外合成mRNA后通過適當修飾和加工，遞送入機體細胞并表達相應蛋白抗原，經(jīng)抗原呈遞細胞呈遞后引發(fā)機體免疫反應［5］。在此過程中，mRNA及其載體可引發(fā)細胞免疫反應，mRNA翻譯后生成的蛋白抗原可引發(fā)體液和細胞免疫反應，體液免疫反應可生成針對病原體的中和抗體。mRNA疫苗在體內(nèi)免疫過程見圖1［6］。mRNA疫苗注射后，注射部位的免疫反應導致大量免疫細胞招募，包括白細胞、髓樣樹突細胞、漿樣樹突細胞和單核細胞等。大多數(shù)類型的免疫細胞均可攝取mRNA疫苗并表達抗原，同時分泌白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）。免疫細胞遷移至引流淋巴結(jié)并呈遞抗原后，抗原與B細胞的相互作用導致生發(fā)中心形成，產(chǎn)生漿細胞和記憶型細胞隨淋巴系統(tǒng)遷移并駐留于骨髓中。

mRNA疫苗主要由編碼抗原的mRNA序列和遞送載體構(gòu)成。根據(jù)mRNA進入體內(nèi)后能否進行自我復制，將mRNA疫苗分為非復制型mRNA疫苗和自我擴增型mRNA（self-amplifying mRNA，SAM）疫苗。前者mRNA的構(gòu)成與傳統(tǒng)mRNA類似，其ORF僅包括編碼抗原的基因；后者mRNA的ORF除包含編碼抗原的核苷酸序列外，還包括來源于病毒的復制元件，翻譯后使mRNA進行擴增，從而持續(xù)表達抗原（≥2個月）［7］。

mRNA遞送載體對于mRNA疫苗的穩(wěn)定性和免疫應答至關(guān)重要。目前常用于mRNA疫苗的遞送載體包括魚精蛋白、脂質(zhì)體及聚合物等。EMA和美國FDA批準上市的疫苗BNT162b2和mRNA-1273均采用脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LNP）作為mRNA疫苗遞送載體。LNP通常由可電離脂類、天然磷脂、膽固醇和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）構(gòu)成［8］。

1.2 特點

與滅活疫苗和減毒活疫苗等傳統(tǒng)類型疫苗相比，mRNA疫苗具有一些特殊的優(yōu)勢：①mRNA疫苗包括mRNA和遞送載體兩部分，其中遞送載體通用性較強；mRNA的免疫學效應依賴于病原體蛋白和核苷酸序列，可通過核酸修飾提高病原體蛋白的翻譯效率，從而增強疫苗活性。理論上，經(jīng)過適當修飾或改造的mRNA可編碼任何一種蛋白。②不同類型mRNA疫苗的生產(chǎn)及純化工藝相似，無需類似于傳統(tǒng)生物類產(chǎn)品較長的生產(chǎn)或發(fā)酵周期，生產(chǎn)過程簡單高效，可快速應對全球爆發(fā)的傳染性疾病。③與DNA疫苗相比，mRNA疫苗在胞質(zhì)中即可翻譯抗原，因此基因整合風險很低。④外源性mRNA本身具有免疫原性，通過激活模式識別受體引發(fā)固有免疫反應，表現(xiàn)出“自我佐劑（self-adjuvant）”的特點。⑤ 遞送載體LNP除穩(wěn)定和保護mRNA外，也具有一定的免疫原性，可增強疫苗的免疫反應。⑥在近年COVID-19疫情中，隨著新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）變異株德爾塔（Delta）和奧密克戎（Omicron）的出現(xiàn)，與其他類型疫苗相比，mRNA疫苗仍表現(xiàn)出有效性和安全性［9-10］。

但目前mRNA疫苗的儲運條件較為苛刻，穩(wěn)定性較差。如已上市的2個mRNA疫苗的儲運條件分別為-70℃（BNT162b2）和 -20℃（mRNA-1273），且因mRNA穩(wěn)定性較差，易被核酸酶降解，對接種環(huán)境的要求亦相對較高。此外，目前的臨床數(shù)據(jù)顯示，接種mRNA疫苗后仍存在一定的不良反應［11］。上述因素使mRNA疫苗的應用面臨較多的挑戰(zhàn)。

2 mRNA疫苗非臨床安全評價相關(guān)指南

mRNA疫苗作為疫苗的一種，應遵循包括但不限于世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）針對疫苗及其佐劑的指導原則［12-13］和ICH S5（R3）中涉及疫苗的生殖毒性試驗的指導原則［14］。mRNA作為基因治療的手段之一，還需參考基因和細胞治療相關(guān)的指導原則［15］。另外，由于mRNA疫苗具有特殊性，WHO于2021年頒布了專門針對mRNA疫苗研發(fā)的指南Evaluation of the Quality，Safety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines for the Prevention of Infectious Diseases：Regulatory Considerations［16］。該指南著重對mRNA疫苗在生產(chǎn)、非臨床和臨床評價過程中的關(guān)鍵點提供指導。值得注意的是，該指導原則雖在COVID-19疫情的大背景下出臺，但并非僅適用于SARS-CoV-2疫苗，也并非適用于所有mRNA疫苗。鑒于LNP為目前最主要的mRNA遞送載體，該指導原則適用于由LNP遞送的mRNA或SAM預防用mRNA疫苗，其他類型遞送載體的mRNA或SAM預防用mRNA疫苗則根據(jù)產(chǎn)品的實際情況靈活應用。該指導原則不適用于由病毒蛋白包裝或質(zhì)粒DNA編碼的疫苗以及治療用mRNA疫苗。

我國藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（Center for Drug Evaluation，CDE）于2005年制定了《預防用生物制品臨床前安全性評價技術(shù)審評一般原則》，主要適用于傳統(tǒng)疫苗如滅活疫苗、減毒活疫苗、純化疫苗、重組DNA技術(shù)制備的抗原疫苗、結(jié)合疫苗、合成肽疫苗以及使用新佐劑疫苗的非臨床安全性評價研究。為應對COVID-19疫情，我國CDE于2020年制定了一系列指導原則，如《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術(shù)指導原則（試行）》《新型冠狀病毒預防用疫苗研發(fā)技術(shù)指導原則（試行）》《新型冠狀病毒預防用疫苗非臨床有效性研究與評價技術(shù)要點》等，但目前尚無針對mRNA疫苗的非臨床安全性研究指導性文件。

3 預防用mRNA疫苗非臨床研究

mRNA疫苗的非臨床研究評價既要符合傳統(tǒng)疫苗研究的一般原則，也因其結(jié)構(gòu)及作用機制的特點、按照“具體問題具體分析”的原則進行科學設計。參考WHO發(fā)布的相關(guān)研究指南［16］，本文就預防用mRNA疫苗的非臨床安全性研究的一般原則及關(guān)注點進行討論。

3.1 一般原則

3.1.1 試驗類型

預防用mRNA疫苗非臨床安全性評價一般應至少進行重復給藥毒性、免疫毒性、局部耐受、安全藥理和生殖毒性試驗等［17-18］，其中免疫毒性、局部耐受和安全藥理試驗可伴隨于重復給藥毒性試驗中開展?？紤]到mRNA疫苗缺少基因整合性，通常無需進行遺傳毒性和致癌性試驗。若疫苗組分中包含有新型的遞送載體、佐劑和（或）賦型劑時，應考慮對新的組分單獨進行全面的非臨床安全性評價，否則應提供充分的理由。

在重復給藥毒性試驗中，常規(guī)檢測指標通常包括動物體重、攝食量、注射部位刺激性反應、臨床病理學指標（血液學、血生化、血凝和尿常規(guī)等）、安全藥理學指標（體溫、心電圖、呼吸頻率和神經(jīng)行為）、臟器重量及組織病理學檢查等指標。此外，還需特別關(guān)注免疫原性及免疫毒性指標，檢測內(nèi)容一般包括與體液免疫（抗病原蛋白抗體及中和抗體）和細胞免疫反應等相關(guān)的免疫細胞（如Th1，Th2，CD4+T和CD8+T細胞等）數(shù)量或比例的改變、細胞因子（白細胞介素、干擾素和集落刺激因子等）水平、急性期蛋白（C-反應蛋白和血清淀粉樣蛋白等）和淋巴免疫組織（給藥部位淋巴結(jié)和脾）病理學檢查等指標。若疫苗組分中有通過直接作用于免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用的成分，或者靶抗原與內(nèi)源性分子存在相似性，尚需關(guān)注由于免疫刺激過強導致超敏反應或自身免疫反應的可能性。此外，由于發(fā)熱是臨床上疫苗接種后常見的反應之一，考慮到非臨床研究中試驗操作的可實施性，可在大動物（如猴和犬等）重復給藥中增加溫度監(jiān)測。

對于脂質(zhì)遞送系統(tǒng)的安全性研究包括組織分布和一般毒性研究。由于單一脂質(zhì)成分的生物分布與遞送系統(tǒng)中脂質(zhì)成分在體內(nèi)可能存在組織分布的差異，可在單次及重復給藥毒性試驗中設置不含mRNA的脂質(zhì)遞送系統(tǒng)對照組，以檢測脂質(zhì)遞送系統(tǒng)的毒性反應［18］。

為預測mRNA疫苗潛在的臨床風險，非臨床研究的試驗樣品需使用能夠代表臨床擬用的疫苗制劑。如非臨床研究使用的樣品與臨床試驗用樣品存在差異，需進行相關(guān)橋接試驗以評估這種差異對疫苗安全性和有效性帶來的潛在影響。

3.1.2 動物種屬選擇

mRNA疫苗的重復給藥毒性試驗一般需在2個相關(guān)動物種屬（嚙齒類和非嚙齒類）中進行，生殖毒性試驗可僅在1個相關(guān)動物種屬中進行。在進行動物種屬選擇時，應考慮實驗動物免疫系統(tǒng)或免疫應答與人體的相似性及所引起免疫反應的強弱等。免疫系統(tǒng)或免疫應答與人越相近或免疫反應越強，則試驗結(jié)果所獲得的毒性信息的評估權(quán)重越高。若非人靈長類是唯一可產(chǎn)生免疫反應的動物種屬，且無適宜的替代分子或人源化的轉(zhuǎn)基因動物時，則mRNA疫苗非臨床安全性評價應考慮采用非人靈長類動物。

3.1.3 劑量設計

mRNA疫苗毒性試驗的劑量設計通常選擇臨床試驗擬用的最高劑量（按人份計），建議增設動物免疫原性和（或）保護力試驗中的最佳劑量，以考察治療劑量下疫苗的毒性風險。此外，高于臨床擬用劑量的設計可支持臨床研究中可能增加的劑量。若受實驗動物給藥體積的限制，試驗劑量難以達到臨床擬用劑量時，可采取相同途徑多點注射的方式；若仍不能達到臨床擬用劑量，至少采用臨床折算劑量（基于公斤體重）進行試驗。免疫次數(shù)和頻率可依據(jù)免疫原性試驗結(jié)果進行設計，通常情況下免疫次數(shù)需比臨床擬定次數(shù)至少多1次。然而，為增強保護力或應對病毒突變，在臨床試驗或應用中不排除使用比初期臨床試驗中更多的免疫次數(shù)。因此，非臨床研究應充分考慮臨床應用中的可能性［19］。

除常規(guī)的劑量設計外，中和抗體滴度也可作為不同種屬動物和臨床人體的“毒代暴露量”。為充分暴露疫苗的潛在風險，安全性試驗中動物產(chǎn)生抗體的滴度應至少涵蓋臨床免疫的有效抗體滴度。

3.1.4 免疫應答

mRNA疫苗注射進入機體后，遞送載體、單鏈mRNA、mRNA自發(fā)形成的二級結(jié)構(gòu)、體外轉(zhuǎn)錄mRNA過程中形成的雙鏈mRNA和mRNA翻譯后形成的抗原均可能激發(fā)機體的固有免疫，而固有免疫對由靶抗原呈遞引起的適應性免疫起著關(guān)鍵作用。固有免疫反應過強，一方面會降低靶抗原的翻譯效率，起不到疫苗的預防作用；另一方面，可能會刺激機體產(chǎn)生較高水平的細胞因子，甚至導致“細胞因子風暴”。固有免疫過弱，則無法誘發(fā)機體產(chǎn)生適應性免疫。因此，平衡固有免疫反應對mRNA疫苗的安全性與臨床應用至關(guān)重要。

在非臨床安全性研究中，可從以下方面考察mRNA疫苗的免疫反應：①T細胞依賴性抗體反應（T cell dependent antibody response，TDAR）是B細胞針對T細胞依賴性抗原產(chǎn)生的抗體應答，需要Th2細胞的輔助方可產(chǎn)生特異性抗體。TDAR試驗可通過引入外來抗原檢測機體產(chǎn)生的IgM和IgG水平，從而反映受試疫苗潛在的免疫毒性。②外周血單個核細胞及全血細胞體外細胞因子檢測可用于篩選有潛在藥理或毒理作用的細胞因子，有助于明確候選疫苗的臨床非預期效應，一般在研發(fā)早期進行。③關(guān)注補體的檢測。寡核苷酸鏈中帶電荷的骨架可能會激活非人靈長類的補體旁路途徑［20-22］，因此在猴重復給藥毒性試驗中需關(guān)注補體的檢測。

此外，若mRNA所編碼的抗原在抗原呈遞細胞中未表達，而在其他細胞中表達時，則可能發(fā)生免疫無能（immune anergy），進而導致免疫耐受。但目前尚無較好的針對免疫耐受評價的試驗方法，組織分布試驗可能有助于判定靶抗原在呈遞細胞中的表達譜，對是否產(chǎn)生免疫耐受有提示作用。

3.1.5 組織分布

研究表明，人體所有細胞均表達低密度脂蛋白受體［23-24］，這些受體可介導LNP包裹的mRNA疫苗的內(nèi)吞作用，因此大多數(shù)細胞均可能是mRNA疫苗的受體細胞。編碼抗原的mRNA在受體細胞中表達及mRNA疫苗自身在相應的組織或器官中的異常聚集和代謝，可能會引發(fā)機體潛在的安全性風險。mRNA納米粒遞送載體材料的組成、表面電荷、粒徑的大小以及疫苗注射方式等均可能影響mRNA疫苗的生物分布。例如，脂質(zhì)體中的PEG可延長體內(nèi)遞送載體的半衰期，減少載體和血漿蛋白的非特異性作用并提供空間位阻增強載體的穩(wěn)定性，但高濃度PEG也可能會抑制LNP與質(zhì)膜的相互作用，從而阻礙細胞對LNP的吸收［25］。帶正電荷的LNP優(yōu)先靶向小鼠肺，帶負電荷的LNP主要靶向脾，不帶電荷的LNP優(yōu)先靶向肝［26-27］。注射到機體組織中粒徑＜200 nm的mRNA疫苗顆粒更易被輸運到淋巴系統(tǒng)，而更大的顆粒則保留在注射部位［28］。因此，mRNA疫苗的組織分布評價，對潛在靶器官及毒性作用的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

目前常用于mRNA疫苗組織分布研究的方法包括免疫熒光法、放射性同位素標記法、近紅外成像技術(shù)和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。免疫熒光法通常是將LNP作為遞送系統(tǒng)包裹螢火蟲熒光素酶mRNA的疫苗注射至動物體內(nèi)，然后通過活體成像觀察熒光素酶的分布而判斷mRNA疫苗的組織分布。由于熒光素酶的表達無法完全模擬編碼抗原mRNA的表達譜，因此免疫熒光法主要評價遞送載體對mRNA疫苗組織分布的影響，具有一定的局限性。放射性同位素標記法和近紅外成像技術(shù)分別是用放射性同位素和近紅外探針標記編碼抗原的mRNA，將mRNA疫苗注射至體內(nèi)后，利用正電子發(fā)射斷層掃描/計算機斷層掃描（PET/CT）和近紅外成像技術(shù)追蹤其組織分布情況，兩者可避免免疫熒光法的缺陷，同時評價遞送載體和抗原mRNA的組織分布，可較全面地檢測mRNA疫苗的分布器官或組織。RT-qPCR是在擬定時間點解剖動物后檢測組織臟器中靶抗原mRNA的水平。RT-qPCR定量準確，操作簡單，是開展組織分布研究常用的方法之一。但該方法以解剖為終點，難以在同一只動物中對疫苗分布情況進行實時動態(tài)監(jiān)測。

3.1.6 生殖毒性

疫苗對機體生殖發(fā)育的不良反應主要是由疫苗與母體免疫系統(tǒng)的直接作用或繼發(fā)作用造成的，如增強的Th1型免疫反應可導致妊娠失敗或流產(chǎn)［29］。此外，如果母體產(chǎn)生的抗體與胚胎或胎仔組織臟器產(chǎn)生交叉反應，特別是抗原分子對處于發(fā)育關(guān)鍵期的器官產(chǎn)生較大影響時，可能使胎仔發(fā)育的器官產(chǎn)生畸形。隨著疫苗應用范圍及人群的擴大，有些疫苗可應用于孕婦，因此開展疫苗生殖與發(fā)育毒性評價非常必要。但由于疫苗給藥劑量較小，尤其是mRNA疫苗在理論上不會進入細胞核，其生殖毒性的風險相對傳統(tǒng)疫苗較低。

單一周期的疫苗注射周期多在妊娠后10～14 d，如傳統(tǒng)的嚙齒類及兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗。但需注意的是，在該周期內(nèi)疫苗一般尚不能充分誘導機體產(chǎn)生充分的疫苗抗體暴露，而且在特定的胚胎發(fā)育周期內(nèi)，不同種屬動物的胎盤轉(zhuǎn)運機制不同，會導致疫苗中和抗體轉(zhuǎn)運效率不同［30］。因此，mRNA疫苗生殖和發(fā)育毒性研究采用全周期的設計方式可能是較好的選擇。

全周期的生殖毒性試驗設計通常需要雌、雄鼠從交配前開始給藥，雌鼠需持續(xù)給藥至妊娠及哺乳結(jié)束，檢測指標至少包括親代雌、雄鼠母體毒性指標（體重和攝食量）、生殖毒性指標（生殖系統(tǒng)重量及組織學檢查、精子活力及形態(tài)學檢查）、胚胎-胎仔發(fā)育毒性（活胎、吸收胎和死胎計數(shù)，胎仔外觀，骨骼和內(nèi)臟檢查）及F1代大鼠生長發(fā)育指標（存活率、體重、生理發(fā)育指標、條件反射指標和學習記憶行為等）。

3.2 其他考慮因素

3.2.1 遞送載體

目前mRNA疫苗最常用的遞送載體為基于平臺技術(shù)的LNP，其組成較為復雜［21］。如前所述，LNP可影響mRNA疫苗的吸收、分布、代謝和排泄過程，進而影響其藥理和毒理效應。此外，LNP本身也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，當LNP的脂質(zhì)成分、構(gòu)成比例發(fā)生改變或存在新的結(jié)構(gòu)修飾時，需考慮對載體進行安全性評價，通常包括一般毒性和遺傳毒性研究。

3.2.2 多聯(lián)多價疫苗

mRNA疫苗作為一種新型疫苗，隨著病毒抗原的變異，疫苗的臨床應用方案可能處于不斷完善和調(diào)整中，在實際臨床應用中也可能遇到各種疑問或挑戰(zhàn)，而這些疑問難以在早期的非臨床研究中得到考察或解釋。例如，①對于多次接種的疫苗，不同技術(shù)路線的疫苗或不同平臺相同靶抗原的mRNA疫苗是否可混合使用？②針對不同靶抗原的mRNA疫苗是否可同時接種？③針對同一病原體的不同亞型的mRNA疫苗是否可同時接種？④同一遞送載體是否可包裹不同靶抗原mRNA？就以上問題，目前國際上尚無明確的指導原則或法規(guī)建議。因此，進行全面的非臨床研究時，除參考我國《聯(lián)合疫苗臨床前和臨床研究技術(shù)指導原則》外，應結(jié)合疫苗作用機制、疫苗非臨床或（和）臨床數(shù)據(jù)，綜合評估多聯(lián)多價疫苗應用時的潛在風險。

4 預防用mRNA疫苗非臨床安全性風險評估

4.1 基于非臨床試驗結(jié)果的綜合評估

mRNA疫苗誘導的免疫功能異常或免疫毒性需要重點關(guān)注。不同種屬動物及人體的免疫功能存在一定差異，故疫苗產(chǎn)生的免疫反應也可能不同。同一疫苗在相同劑量條件下，不同種屬動物產(chǎn)生的中和抗體滴度可能存在較大差異，甚至在某一動物種屬可能不會產(chǎn)生特異性中和抗體。因此，非臨床試驗中需選擇疫苗敏感的動物種屬且中和抗體滴度超過臨床研究的有效抗體滴度，一般才能為安全性評價提供更充分的風險評估。同時，不同種屬間免疫毒性研究結(jié)果的差異也需進行綜合評估。

除體液免疫反應外，mRNA疫苗還可調(diào)節(jié)部分T細胞的免疫功能。mRNA疫苗在一定程度上模擬病毒感染，因而可促進CD8+T細胞反應；CD4+T細胞也可參與B細胞分化從而建立疫苗的免疫記憶反應。例如，某編碼RABVG基因的mRNA疫苗在體外系統(tǒng)、小鼠及小型豬中可誘導RABVG特異性的CD4+和CD8+T細胞反應，干擾素γ、腫瘤壞死因子、IL-2和CD107a表達明顯升高［31］。而該疫苗在Ⅰ期臨床試驗中僅在第3次接種后可見一過性的RABVG特異性的CD4+T細胞反應［32］。Moderna公司的預防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗在小鼠體內(nèi)可誘導明顯的CD4+和CD8+T細胞反應，包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S蛋白）或受體結(jié)合區(qū)域特異性干擾素γ分泌增加［33-35］，而在猴和人體內(nèi)僅可見特異性CD4+T細胞反應［36-37］。

除免疫毒性外，也應關(guān)注疫苗的一般毒性，尤其是新型遞送系統(tǒng)帶來的潛在毒性。例如，在毒性試驗中，mRNA疫苗給藥動物肝組織出現(xiàn)與LNP遞送載體相關(guān)的空泡性改變［38-40］，這可能與LNP遞送載體在肝分布濃度較高或留存時間較長相關(guān)，提示應關(guān)注并評估m(xù)RNA疫苗臨床接種后的風險。

4.2 基于臨床-非臨床的綜合評估

mRNA疫苗的臨床轉(zhuǎn)化應基于對已有臨床數(shù)據(jù)的分析，尤其是臨床使用中出現(xiàn)的不良反應及其機制對指導mRNA疫苗非臨床研究具有重要的指導意義。臨床試驗及應用中發(fā)現(xiàn)，mRNA疫苗接種者常見的疫苗不良反應包括疲勞、發(fā)冷、頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱和頭暈等。有研究認為，LNP組分如PEG和電離脂質(zhì)體等可激活不同的炎癥途徑，導致炎癥細胞因子如IL-1和IL-6的產(chǎn)生，且LNP可擴散至全身各處，進而導致局部或全身炎癥，可能是造成mRNA疫苗不良反應的主要因素之一［41］。此外，近期的一些研究發(fā)現(xiàn)，與對照組人群相比，mRNA疫苗接種人群腦血管疾病、栓塞性卒中、短暫腦缺血、深靜脈血栓、心肌炎（心包炎）和過敏反應的發(fā)生率略微升高［12，42-45］。腦血管疾病、栓塞性卒中、短暫腦缺血和腦靜脈血栓可能是由免疫性血栓性血小板減少癥（vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia，VITT）導致［46］。VITT在疫苗接種人群的發(fā)生率并不高，然而由于其導致的后果較為嚴重，需密切關(guān)注。VITT致病機制并不明確，可能的原因包括由血小板因子4（platelet factor 4，PF4）抗體和S蛋白作用導致，其中PF4為荷正電的血小板蛋白，與荷負電的分子如mRNA疫苗的組分結(jié)合后，形成具有免疫原性的復合物，可誘發(fā)機體產(chǎn)生PF4-聚陰離子抗體，進一步激活下游通路導致血小板減少和（或）血栓形成［43，47］。對于S蛋白導致VITT的作用機制，可能是SARS-CoV-2疫苗特異性作用導致。研究表明，SARS-CoV-2游離的S蛋白可直接活化血小板，導致凝血因子釋放，最終導致血栓和（或）血小板減少［47-48］。關(guān)于VITT的致病機制還需進一步研究，如在mRNA疫苗非臨床研究中，可通過檢測PF4-聚陰離子抗體及游離S蛋白的含量評估疫苗的潛在毒性?；赩ITT發(fā)病率較低，在非臨床研究中少數(shù)個體動物PF4-聚陰離子抗體及游離S蛋白含量的升高，可能具有相關(guān)潛在毒性的提示性。

心肌炎（心包炎）和過敏反應是目前報道較多的mRNA疫苗相關(guān)的另外2類不良反應［12，42］。有研究表明，心肌炎（心包炎）發(fā)生人群多為青少年群體，且mRNA-1273（美國Moderna）所致心肌炎（心包炎）發(fā)生率高于BNT162b2（德國BioNTech/美國輝瑞）［48］。臨床試驗結(jié)果顯示，BNT162b2在5～11歲兒童中具有良好的安全性，未發(fā)現(xiàn)心肌炎（心包炎）等與疫苗相關(guān)的嚴重不良事件［49］。因此，德國衛(wèi)生部門建議≤30歲人群接種BNT162b2，而非mRNA-1273。小鼠靜脈注射BNT162b2后雖可見急性心肌炎（心包炎），然而考慮到與臨床給藥方式的差異，此研究對mRNA疫苗導致心肌炎（心包炎）的原因探索仍然有限［50］。另一方面，mRNA疫苗過敏反應與個人的過敏史以及過敏原接觸史相關(guān)［51］，過敏原包括mRNA疫苗中的PEG、與PEG結(jié)構(gòu)類似的聚山梨醇酯以及常用于其他疫苗或治療用藥物的賦形劑［52-53］。由于上述2種不良反應的機制尚不明確，非臨床研究中進行針對性的毒性試驗與評估較為困難，主要通過臨床使用前及使用后進行風險把控，如心肌炎（心包炎）發(fā)病后對癥治療及接種前對擬接種人群的過敏史進行調(diào)研等［51］。

值得一提的是，有學者認為接種SARS-CoV-2 mRNA疫苗并不會導致上述如心肌炎（心包炎）和VITT等不良反應，接種疫苗后一些不良反應的風險有某種程度的降低［54］。因此，累計更多mRNA疫苗的臨床數(shù)據(jù)對于科學評估m(xù)RNA疫苗的不良反應具有重要價值。

mRNA疫苗遞送至體內(nèi)后，其自身會誘發(fā)細胞免疫，引起Ⅰ型干擾素升高。Ⅰ型干擾素本身即作為多種疾病的治療靶點［55］，其升高或降低會導致人體免疫失衡。此外，Ⅰ型干擾素升高可抑制mRNA的翻譯效率，從而影響mRNA疫苗預防感染的效果［56-57］。因此，mRNA疫苗在老、弱、婦、幼及免疫反應過高或過低的人群中使用的可能性和（或）劑量范圍，應通過非臨床和臨床研究數(shù)據(jù)進行風險-收益的權(quán)衡分析。

總之，非臨床和臨床研究人員需及時關(guān)注相關(guān)領(lǐng)域的基礎研究，找到合適的毒性評估手段，以降低mRNA疫苗臨床應用及轉(zhuǎn)化的風險，尤其是潛在的遠期毒性風險。

5 加快預防用mRNA疫苗上市以應對重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件的可能性

近期肆虐全球的COVID-19疫情事件中，EMA授權(quán)mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273緊急使用（Emergency Use Authorization），整個審批周期＜80 d。我國CDE建立了“研審聯(lián)動，隨研發(fā)隨提交，隨提交隨審評”的審評工作機制，僅用時4個月就有4個滅活疫苗和1個重組腺病毒載體疫苗獲準進入臨床試驗。除審評機制外，結(jié)合mRNA疫苗在技術(shù)和作用機制方面的特點，在此探討加快審評的技術(shù)可行性。

相對傳統(tǒng)疫苗而言，mRNA疫苗具有一個較大的技術(shù)優(yōu)勢，即快速研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化?；诔墒斓钠脚_技術(shù)及積累的非臨床和（或）臨床數(shù)據(jù)，是表征疫苗安全性的一個重要參考因素。WHO關(guān)于預防用mRNA疫苗的指導原則中提及以下情況可考慮適當縮減非臨床評估過程以加快審批［17］。①對于已有臨床數(shù)據(jù)的mRNA疫苗，如果只是修改靶抗原的mRNA序列而不改變疫苗的其他方面者，如LNP結(jié)構(gòu)、組成比例和LNP/mRNA比例等。例如，流感病毒疫苗有可能針對變異SARS-CoV-2病毒的疫苗，如其生產(chǎn)工藝經(jīng)批準，其非臨床研究可適當減少。此類情況應盡可能收集相關(guān)疫苗的臨床和非臨床數(shù)據(jù)，包括已有相關(guān)的獸用疫苗，其非臨床研究也有一定的參考意義。此外，非良好實驗室規(guī)范（Good Laboratory Practice，GLP）條件下的組織分布研究、攻毒實驗等數(shù)據(jù)也可作為參考。值得注意的是，最新研究表明，LNP的大小可能會影響疫苗的免疫原性，因此若LNP粒徑發(fā)生改變，至少應評估其對免疫原性的潛在影響［58］。②基于平臺技術(shù)的mRNA疫苗，若該平臺其他產(chǎn)品（如相同遞送載體的mRNA疫苗）已有夯實的、可供監(jiān)管機構(gòu)進行風險-收益評估的資料信息，包括非臨床毒理學數(shù)據(jù)及臨床試驗和（或）應用的經(jīng)驗數(shù)據(jù)，其非臨床重復給藥毒性試驗可與Ⅰ期臨床試驗同步進行。值得注意的是，如果mRNA疫苗本身針對的病原體與免疫反應相關(guān)，則靶抗原mRNA可能會導致免疫毒性增強，在非臨床研究中應予以充分評價。

若mRNA疫苗由新型遞送載體和新靶抗原mRNA構(gòu)成，則減免非臨床研究的可能性較小。但在面對重大突發(fā)公共衛(wèi)生安全事件時，應充分與監(jiān)管機構(gòu)溝通，探討可能快速推進臨床試驗的方案和策略。

6 mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273的非臨床研究

以下總結(jié)了目前全球已上市的針對COVID-19的2款mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273的非臨床試驗及相關(guān)試驗結(jié)果。在此需明確的是，該總結(jié)僅基于EMA官方網(wǎng)站公開的信息［38-39］，是否存在其他未公開的資料尚不清楚。還需強調(diào)的是，疫苗關(guān)系人民的健康安全，由于各國國情不同，mRNA疫苗研發(fā)技術(shù)平臺與產(chǎn)業(yè)化成熟度不同，監(jiān)管機構(gòu)對mRNA疫苗的技術(shù)要求可能存在差異。

6.1 BNT162b2

BNT162b2于2020年12月被EMA有條件批準上市用于≥16歲人群預防感染SARS-CoV-2。BNT162b2是全球首款獲批上市的mRNA疫苗，由遞送載體LNP及編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA構(gòu)成，其中遞送載體包含ALC-0315和ALC-0159 2種新脂質(zhì)輔料。臨床免疫方案為2次間隔21 d肌內(nèi)注射，每人每劑30 μg。

有含2種新LNP輔料的LNP包裹替代分子熒光素酶mRNA，用大鼠研究了2種新輔料的藥動學和生物分布特征。結(jié)果顯示，肝為2種新輔料的主要分布器官。以Wistar Han大鼠進行重復給藥毒性試驗，每周1次肌內(nèi)注射，共3次，毒性反應主要表現(xiàn)為注射部位的免疫反應（水腫和紅斑），免疫細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）增加，紅細胞系輕度減少，脾、引流淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)增大及可逆性的肝毒性。其中，肝毒性主要表現(xiàn)為肝細胞腫大和空泡變及谷酰轉(zhuǎn)肽酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平升高，這可能與LNP在肝的分布相關(guān)；其他毒性反應與大多數(shù)mRNA疫苗相同。BNT162b2重復給藥毒性試驗未發(fā)現(xiàn)mRNA疫苗特異的毒性反應。

BNT162b2的生殖毒性試驗中采用全周期設計，大鼠分別于交配前21和14 d以及妊娠第9和20天肌內(nèi)注射給藥，雄鼠交配結(jié)束后解剖，雌鼠于妊娠期21 d及產(chǎn)后21 d分批解剖。結(jié)果顯示，BNT162b2對親代生殖、胚胎-胎仔形成和子代發(fā)育均未見明顯不良反應。

6.2 mRNA-1273

mRNA-1273于2021年1月由EMA有條件批準上市用于≥18歲人群預防感染SARS-CoV-2。mRNA-1273由LNP包裹編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白mRNA構(gòu)成，其遞送載體中包含新型輔料SM-102。臨床免疫方案為2次間隔28 d肌肉注射，每人每劑100 μg。

mRNA-1273重復給藥毒性試驗結(jié)果表明，其毒性反應與BNT162b2基本類似。該研究雖在非GLP條件下進行，但申辦方提供了其他6個GLP條件下與mRNA-1273遞送載體相同、但編碼抗原不同的mRNA疫苗的非臨床試驗數(shù)據(jù)，通過對比其毒性反應的相似性，推測mRNA-1273的毒性反應主要與遞送載體相關(guān)，與編碼抗原的mRNA無關(guān)。mRNA-1273的生殖毒性試驗也采用全周期設計，在大鼠交配前和妊娠期間各肌內(nèi)注射2次。結(jié)果顯示，mRNA-1273對親代生殖、胚胎-胎仔形成和子代發(fā)育均未見明顯不良反應。

對以上資料分析可見，BNT162b2重復給藥試驗的給藥周期（共17 d）并未完全涵蓋人體的臨床免疫方案（間隔21 d）；mRNA-1273的重復給藥毒性試驗為非GLP試驗。生殖毒性試驗中，未見考察mRNA本身、遞送載體本身及mRNA疫苗所誘導產(chǎn)生的中和抗體胎盤轉(zhuǎn)運及乳汁分泌的資料。此外，未見針對其中所含新型輔料的相關(guān)毒性研究，僅通過藥代數(shù)據(jù)和查閱的資料說明其安全性。未見mRNA-1273單獨的組織分布研究，僅以相同LNP包裹的一種巨細胞病毒糖蛋白mRNA疫苗進行了類比評價。

通過以上資料推測，在面臨全球重大公共衛(wèi)生事件時，BNT162b2和mRNA-1273似采用簡化的非臨床研究、基于已有的科學證據(jù)（疫苗本身和平臺技術(shù)）加快審批及臨床轉(zhuǎn)化，最終實現(xiàn)了有條件批準緊急使用。

7 mRNA疫苗非臨床研究面臨的挑戰(zhàn)和展望

隨著mRNA-1273獲得緊急批準使用以及BNT162b2全面批準上市，全球包括我國有越來越多的制藥企業(yè)和研發(fā)機構(gòu)投入該領(lǐng)域。我國艾博生物研發(fā)的首個國產(chǎn)mRNA疫苗ARCoVaX（ARCoV）Ⅰ期臨床試驗表明，ARCoV安全性和耐受性良好，且能夠誘導強烈的體液和細胞免疫反應。此外，ARCoV較BNT162b2和mRNA-1273表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，可在2～8℃保持穩(wěn)定≥6個月，這為mRNA疫苗的臨床應用提供了較大的便利［59］。雖然mRNA疫苗具有較大的技術(shù)優(yōu)勢，但與其他類型的疫苗相比，其臨床轉(zhuǎn)化仍面臨不小的挑戰(zhàn)，其中一個較大的擔憂是非臨床研究數(shù)據(jù)外推至臨床應用的局限性。不同動物種屬的同類受體在結(jié)構(gòu)和（或）功能上可能存在差異，因而導致疫苗在不同種屬間可能存在生物活性的差異，甚至導致不同的免疫反應。其次，自身免疫反應的評價尚無較好的動物模型，導致非臨床試驗設計的局限性。第三，對于一類新型傳染性疾病的疫苗，非臨床試驗結(jié)果對臨床使用的劑量及免疫反應的持續(xù)時間提供的數(shù)據(jù)支持有限，疫苗臨床使用的安全性和有效性更多依賴于Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗。

在全球范圍內(nèi)，mRNA疫苗一直在持續(xù)地創(chuàng)新發(fā)展，如用含有內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site）的環(huán)狀RNA代替mRNA編碼抗原，及以選擇性內(nèi)源性衣殼化的細胞遞送（selective endogenous encapsidation for cellular delivery）系統(tǒng)為代表的新型載體等將成為下階段的研究熱點之一［60］。現(xiàn)有針對mRNA疫苗的指導原則并不一定適用于創(chuàng)新性mRNA疫苗，這勢必給mRNA疫苗的非臨床和臨床研究帶來挑戰(zhàn)。因此，在創(chuàng)新型mRNA疫苗的非臨床安全性評價中，應遵循逐案分析原則，在遵循GLP規(guī)范性的前提下，科學合理地開展非臨床研究，更全面地提示mRNA疫苗臨床應用中的潛在風險。