納米氧化鐵的遺傳毒性及其機制研究進展

趙澤浩，趙田田，王敬亭，周長慧，朱海美，常 艷

（1.上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201201；3.復旦大學藥學院，上海 201203；4.上海工程技術大學化學化工學院，上海 201620）

根據(jù)美國國家納米技術計劃的定義，納米材料指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）或由其作為基本單元組成的材料，廣泛應用于化妝品、衛(wèi)生、服裝、電氣、農業(yè)、食品和醫(yī)藥等領域［1］。納米鐵是應用最為廣泛的納米材料之一。納米鐵及其氧化物材料的納米效應使其展現(xiàn)出許多特殊性質，擁有較大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用空間，具有重要研發(fā)價值。鐵是地殼中含量最豐富的金屬之一，是血紅蛋白的重要組成部分，也是細胞內幾種酶和電子傳遞系統(tǒng)中必不可少的元素［2］。在醫(yī)藥研究領域，超順磁納米氧化鐵（superparamagnetic nano-iron oxide，SPNIO）是納米氧化鐵（nanoiron-oxide，NIO）中具有特殊超順磁性的一類，在外部磁場作用下表現(xiàn)出獨特的導向性，可用于磁性轉染、細胞標記、磁熱療及藥物載體等［3］，還可作為臨床腫瘤組織造影劑和抗腫瘤藥物，如已上市的欣諾（Sinerem），瑞素維特（Resovist），Supravist和Ferridex［4］。

納米材料可通過空氣、水和食物等方式進入人體，基于納米材料的潛在危害性及廣泛暴露于人群的特性，其安全性也日益受到重視。與微米級和尺寸較大的顆粒相比，納米粒子具有更大的比表面積，并具有高化學反應活性，更有可能被人體吸收，聚集到不同器官，發(fā)生更多化學反應和生物反應，增加產生遺傳毒性的風險。研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子在細胞、亞細胞和分子生物學水平（如基因和蛋白水平）等均可產生一定遺傳毒性效應。廣泛應用于醫(yī)療器械和造影劑領域的納米鐵藥物（如SPNIO）在進入人體后可能通過長期蓄積進而誘導氧化應激等反應，引起染色體或DNA損傷［3］。

NIO是應用較為廣泛的醫(yī)用納米材料之一。本文簡要介紹納米氧化鐵的分類和制備方法，并以常用的納米零價鐵（Fe0）（nanoscale zero valent iron，NZVI）和SPNIO為例，介紹NIO的遺傳毒性研究進展及潛在致毒機制，為納米材料遺傳毒性評價及遺傳毒性機制研究提供參考。

1 納米氧化鐵的分類和制備

1.1 分類

自然環(huán)境中的鐵存在于固溶態(tài)的三價鐵鹽或亞鐵鹽中，或固溶于鐵氧化物中，如針鐵礦和赤鐵礦等。通常，人們將鐵的氧化物及其羥基氧化物歸屬于氧化鐵系列化合物，按價態(tài)、晶型和結構的不同可分為（α-，β-，γ-）Fe2O3，（α-，β-，γ-，δ-）FeOOH，F(xiàn)e3O4和FeO等；按用途可分為顏料氧化鐵和磁性氧化鐵。較具實用價值的有α-Fe2O3，γ-Fe2O3，α-FeOOH和Fe3O4等。

NIO包括SPNIO和NZVI。其中SPNIO屬于NIO中具有特殊超順磁性的一類，與去除磁場后仍保持磁性的多疇鐵磁材料不同，SPNIO會在磁場關閉的同時失去磁性。同時可在室溫保持膠體的穩(wěn)定性，不易發(fā)生團聚［5］，提高了其生物安全性，這些特性使SPNIO更易應用于醫(yī)藥領域。NZVI是一種人工合成的工程材料，內芯由零價鐵組成，并非天然存在的鐵的價態(tài)，而外殼由鐵的氧化物構成，因此也屬于NIO。Fe0的存在使NZVI表現(xiàn)出極強的還原性，常用于污水處理中藥物降解與去除。

1.2 制備方法

納米氧化鐵的合成方法可分為3類：①物理方法，包括熱解、氣溶膠、電子束光刻、超聲、氣相沉積和微波合成等；②化學方法，包括共沉淀法、熱分解法、微乳液法、化學沉積法、水熱/多元醇法和微波輔助合成法等；③生物方法。使用微生物或植物提取物來合成納米粒。該法的主要優(yōu)點是節(jié)能無毒，且還原劑供應充足，經濟成本較低；主要缺點是制備出的納米粒子性質不穩(wěn)定，會影響其應用。

2 常用的納米氧化鐵及其應用

NIO廣泛用于生物醫(yī)學領域，例如磁熱療、磁共振成像、基因傳遞和組織成像等［6］。NIO晶體核心可由3價鐵（Fe3+）磁性材料或2價鐵（Fe2+）磁性材料制成，通過化學修飾使無機、有機或聚合物等材料包被在其表面，此外還可與磁共振成像造影劑結合用于腦炎期間激活的小膠質細胞成像、干細胞示蹤、裝載NIO的細菌進行圖像引導的貧血治療，或進行血管成像等［7］。

近幾十年，NIO在癌癥治療中取得了突破性進展，已有研究發(fā)現(xiàn)，鐵氧體（CuFe2O4）納米粒子暴露于人乳腺癌MCF-7細胞，氧化鐵鈷（CoFe2O4）納米粒子暴露于人肝細胞（HepG2），可通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加細胞毒性引起細胞凋亡［8］。

2.1 超順磁納米氧化鐵

SPNIO具有出色的磁性、電子和光學特性，已成為臨床研究的重點之一。其大比表面積和疏水特性會使其更易聚集，因此具有穩(wěn)定表面修飾的SPNIO才能適用于生物醫(yī)學應用。SPNIO通常由直徑為5～20 nm的氧化鐵芯組成。氧化鐵芯由磁鐵礦（Fe3O4）及其氧化形式的磁赤鐵礦（主要成分為Fe2O3）制成。通過使用幾種類型的包覆涂層材料，如右旋糖酐、殼聚糖和聚乙二醇等修飾SPNIO表面，可增加其膠體穩(wěn)定性和生物相容性，制成適合臨床使用的懸浮劑［9］。SPNIO在臨床上常用作造影劑，目前已上市的SPNIO造影劑（如欣諾，瑞素維特，Supravist和Ferridex等）均具有葡聚糖或羧基葡聚糖表面包覆涂層，形成的蛋白質電暈使粒子穩(wěn)定性增加，生物相容性更好。此外，SPNIO還適用于體外診斷測試、體內成像、靶向藥物遞送和組織再生等領域。SPNIO還具有在外部磁場下產熱的特性，可用于磁熱療靶向破壞腫瘤組織治療和組織工程領域［10］。Paolini等［11］研究了由鼠李糖包覆的SPNIO，有望通過磁流體熱療的方法治療膠質母細胞瘤。

2.2 納米零價鐵

NZVI是一種工程材料，其核心主要由Fe0組成，外殼主要由Fe0氧化形成的鐵氧化物/氫氧化物構成［12］。

由于NZVI具有的殼核結構〔（Fe0)內核-鐵氧化物表面〕，表現(xiàn)出獨特的吸附性和還原性，因此在土壤和地下水有機污染物和重金屬修復領域有著廣泛應用。在過去十年中，NZVI越來越多地被用于凈化水、土壤和沉積物，還可被用于降解藥物。NZVI粒子通過Fe0核的氧化以及隨后將電子分配給污染物來減少毒性物質。如NZVI可將污染物（如多氯代烴、高氯酸鹽、硝酸鹽、鉻酸鹽、亞硒酸鹽、氯化物和有機染料等）還原為危害較小或穩(wěn)定的化合物［13］。

3 納米氧化鐵的遺傳毒性

NIO可通過產生ROS誘導各種癌細胞系的細胞毒性。Ansari等［8］通過透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和X射線衍射對NIO進行檢測，結果表明，NIO可與DNA形成復合物，并插入DNA的堿基對之間；體外實驗觀察到大鼠淋巴細胞的細胞活力呈現(xiàn)NIO濃度依賴性下降，而ROS生成增加，并觀察到抗酶活性的降低以及脂質過氧化作用呈現(xiàn)NIO濃度依賴性增加，因此推測其通過產生ROS引起體內遺傳毒性。

而Kaygisiz等［14］采用不同測試系統(tǒng)比較了不同粒徑NIO的遺傳毒性。利用翅體突變與重組實驗（somatic mutation and recombination tests，SMART）、蔥根實驗和彗星實驗研究了粒徑為50和100 nm NIO的遺傳毒性。在SMART實驗中，僅粒徑為50 nm的NIO表現(xiàn)出明顯的遺傳毒性。

Sonmez等［15］通過熱分解法制備了直徑為20 nm的NIO，通過姐妹染色單體互換、微核和染色體畸變實驗以及對8-氧-2-脫氧鳥苷的測定來評價其遺傳毒性。結果表明，該粒子可引起人淋巴細胞DNA氧化損傷，產生遺傳毒性，并對淋巴細胞產生細胞毒性作用，且呈濃度依賴性。

這些研究結果表明，NIO的粒徑和濃度是影響其遺傳毒性的關鍵因素，不同大小的納米粒子可能因表觀形態(tài)不同，具有不同的遺傳毒性。

3.1 超順磁納米氧化鐵

由于納米鐵表面的高催化性，包覆它們的涂層能起到屏障作用，降低毒性，且納米鐵誘導的毒性與細胞攝取量高度相關，因此需研究SPNIO能否進入細胞，甚至能否進入細胞核，從而與DNA相互作用。P?ttler等［16］采用3種不同的SPNIO：包覆月桂酸（SPNIO-lauric acid，SPNIOLA）、包覆月桂酸和白蛋白（SPNIOLA-bovine serum albumin，SPNIOLABSA）及包覆右旋糖酐（SPNIO-dextran，SPNIODEX）處理細胞，通過微波等離子體原子發(fā)射光譜分析細胞裂解液中的鐵含量。結果表明，SPNIOLA能被細胞有效攝取，而SPNIOLA-BSA僅被少量攝取，SPNIO-DEX則完全不被攝?。?7］。其他研究還表明，細胞對SPNIO的攝取效率取決于表面包覆的涂層和蛋白質電暈［18］。因此，推測SPNIO的表面涂層通過影響細胞攝取，進而產生不同的遺傳毒性效應。攝入細胞的SPNIO越少，越難檢測其遺傳毒性。

SPNIO在組織與器官中的積蓄可能會產生一定毒副作用。在靶向成像和藥物輸送領域，SPNIO可在外部磁場作用下，被引導到特定靶區(qū)域（組織/器官），因此在同一靶區(qū)可能存在高濃度鐵。大量研究證明，SPNIO濃度≥100 kg·L-1時，可引起細胞毒性，隨后組織中高濃度鐵離子導致穩(wěn)態(tài)失衡和異常細胞反應，如氧化應激、DNA損傷和炎癥反應等，從而產生遺傳毒性甚至癌變［19］。

有研究以α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（αtocopheryl-polyetheleneglycol-succinate，TPGS）和十二烷基二甲基溴銨（didodecyldimethyl-ammonium-bromide，DMAB）為表面活性劑，通過乳化法制備了2種SPNIO。其中SPNIO-TPGS（180 nm）的粒徑大于SPNIO-DMAB（25 nm）和裸的SPNIO（10 nm），2種制劑均帶正電。在體外彗星實驗中，表面有包覆的SPNIO對人淋巴細胞的遺傳毒性和ROS生成量均低于裸的SPNIO，其中，SPNIODMAB遺傳毒性最小［4］。表明包覆材料可能影響SPNIO遺傳毒性。Hong等［20］制備了包覆正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、3-氨基丙基-三甲氧基硅烷〔（3-aminopropyl）trimethoxysilane，APTMS〕、TEOS-APTMS、檸檬酸鹽SPNIO以及裸的SPNIO，粒徑分別為100～150，10，100～150，10和10 nm，并檢測了這幾種SPNIO對成纖維細胞L-929活性與遺傳物質的影響。彗星實驗結果顯示，裸的SPNIO及覆有TEOS的SPNIO結果為陰性；經APTMS和TEOS-APTMS包覆的SPNIO，呈現(xiàn)濃度依賴性遺傳毒性作用，這2種SPNIO均攜帶正電荷，而DNA攜帶負電荷，表明帶有正電荷的SPNIO通過核孔進入細胞核，并直接與DNA相互作用。不同表面包覆和粒徑的SPNIO會引起輕微但可能有意義的細胞毒性和遺傳毒性改變，這在進一步研究生物偶聯(lián)和藥物遞送、細胞培養(yǎng)和腫瘤靶向應用方面具有重要價值。

3.2 納米零價鐵

NZVI廣泛應用于去除污水（地面/地表）和土壤中的重金屬、多環(huán)芳烴、氯化有機化合物和無機化合物［21］。NZVI在環(huán)境中具有很高的遷移能力，還能與化學污染物和生物體相互作用。關于NZVI在植物中的遺傳毒性已有一定研究，Ghosh等［22］使用氯化三苯四氮唑法、偶氮藍細胞毒性實驗和彗星實驗分析了NZVI對煙草花葉細胞BY-2產生的毒性作用。結果顯示，NZVI在5 μg·mL-1就可產生細胞毒性與高DNA損傷。ROS的定性和定量測定證實，在低濃度NZVI作用下，細胞中積累了一定量的超氧陰離子、羥基、過氧自由基和過氧化氫［23］。因此證實了由ROS介導的NZVI細胞毒性和基因毒性，并為NZVI的安全性評價以及其他生態(tài)毒理學相關納米材料的毒性測試提供了一定數(shù)據(jù)支持。

?evc?等［13］研究發(fā)現(xiàn)，NZVI可間接生成破壞鐵硫基ROS，而鐵硫基是許多酶中的輔助因子，導致發(fā)生芬頓（Fenton）反應，并催化產生更多ROS。生成的ROS釋放到細胞質中并誘導線粒體中ROS釋放，導致細胞損傷和死亡。NZVI產生ROS觸發(fā)氧化應激反應的潛力受多種因素影響，如包覆涂層、流動性、粒徑和測試環(huán)境中有機物或溶解鹽濃度等。在評估和比較毒性反應時，可通過測量細胞對NZVI或Fe2+的吸收以及NZVI的團聚和氧化狀態(tài)進行評估。

4 納米氧化鐵遺傳毒性機制

4.1 氧化應激反應

ROS是一種從分子氧中衍生出來的活性分子和自由基，如羥基自由基、超氧陰離子和非自由基過氧化氫，NIO在需氧生物體內被溶解氧化，生成Fe2+和 OH-。Fe2+可通過芬頓反應（Fe2++H2O2→Fe3++OH·+OH-［24］），進一步氧化為 Fe3+，使活性較低的過氧化氫（線粒體氧化呼吸產物）轉變成更強活性和高毒性的羥基自由基。高活性羥基自由基可損傷線粒體內包括脂質、蛋白質和DNA等大分子，導致基因組不穩(wěn)定、細胞器失調、細胞損傷或凋亡［25］。DNA損傷包括一系列廣泛性損傷，如基因組重排和基因鏈斷裂等。過量ROS和隨后發(fā)生的氧化應激反應會進一步導致染色體畸變、細胞凋亡和癌變等，產生強烈遺傳毒性［26］。有研究表明，Wistar大鼠靜脈給予NIO后會通過產生ROS誘導氧化應激，擾亂機體抗氧化系統(tǒng)［27］。Wistar大鼠口服給予NIO 1周會導致過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化酶水平下降。其他研究也表明，NIO通過脂質過氧化、消耗谷胱甘肽和誘導氧化應激反應造成遺傳物質損傷［14］。表明納米氧化鐵誘導的氧化應激反應是其遺傳毒性背后的原因。

4.2 DNA損傷

對于NIO引起的DNA損傷，可能的機制有2種。①細胞暴露于具有氧化還原活性的NIO中，通過芬頓反應產生ROS，導致DNA和RNA損傷［13］。線粒體作為ROS生成場所，其DNA比核DNA對氧化損傷更敏感。ROS中最活躍的羥基自由基能攻擊DNA堿基和糖基部分，從而導致糖基片段化和DNA鏈斷裂，鏈斷裂比堿基損傷對細胞造成的傷害更嚴重，對細胞更具致死性。Královec等［28］研究了由二氧化硅包覆的NIO對人腎近端小管上皮細胞（HK-2）的遺傳毒性。結果表明，二氧化硅包覆的NIO 25和100 mg·L-1短期（1 h）暴露于HK-2細胞，就可引起細胞嚴重DNA損傷，即以DNA雙鏈斷裂形式出現(xiàn)致死性損傷。此外有研究報道，二氧化硅包覆的NIO對L5178Y細胞［29］、A549細胞和HeLa細胞［30］DNA的損傷作用與對HK-2細胞的作用結果相似。②NIO通過核孔進入細胞核，直接與DNA相互作用。Ansari等［8］采用熒光光譜法，用3種DNA結合型染料〔吖啶橙、煙酸己可堿（Hoechst）和 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole〕研究NIO與DNA的結合方式，評估兩者的相互作用。結果表明，NIO可能通過插入DNA堿基對而直接損傷DNA。Wistar大鼠ip給予NIO后，染色體畸變率和微核誘導率呈現(xiàn)劑量依賴性增加，表明NIO以染色體畸變及微核形式誘導遺傳毒性。

4.3 其他

某些NIO也可能導致其他形式損傷，如膜損傷、蛋白質變性、遺傳毒性、免疫反應性和異物肉芽腫形成［31］。有研究報道，SPNIO還可引起細胞干擾，如肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、基因表達譜失調、鐵穩(wěn)態(tài)紊亂以及細胞應答改變，如信號通路激活和細胞周期調節(jié)障礙［32］。理化性質的改變會影響物質的生物活性，NIO表面包覆材料種類繁多，這些可能產生未知的毒性機制，因此在研究NIO的毒性前需了解其化學成分、表面結構、粒徑、溶解性和聚集性等性質。

5 結語與展望

納米技術可通過多種方式改善常規(guī)藥物的理化性質和生物學特性。以SPNIO為代表的生物醫(yī)用納米材料，作為臨床腫瘤組織造影劑和抗腫瘤藥物具有良好應用前景和重要研發(fā)價值。納米氧化鐵粒子的表面物理化學特性使其可跨越不同生物屏障，擴散到幾乎每種類型細胞中，但同時也會產生一定的副作用。產生的遺傳毒性效應有DNA損傷（如鏈斷裂、加合物形成及基本位點突變）、染色體異常（如染色體數(shù)目或結構的改變）和微核的形成。但NIO等納米材料的致毒機制尚未明確［33-34］。有研究支持的毒性機制之一是產生ROS，引起氧化應激，從而通過調節(jié)細胞內鈣濃度、激活轉錄因子和誘導細胞因子產生而觸發(fā)炎癥反應［35-36］。炎癥和氧化應激破壞包括脂質、蛋白質以及DNA在內的生物分子，進而造成細胞和組織損傷，最終導致與疾病相關的遺傳毒性、細胞毒性和纖維化反應［37］。造成納米鐵材料毒性作用機制尚未明確的可能原因是未建立高效且標準化的納米粒子毒性篩選方法［38］。目前對于納米氧化鐵的毒性評價較少，因此迫切需要開發(fā)納米氧化鐵相關安全性和生物相容性評價方法，尤其是遺傳毒性研究評價方法。遺傳毒性實驗的關鍵是需要涵蓋所有必要的終點：基因突變、染色體畸變（斷裂性）和染色體數(shù)量的變化（非整倍體）。由于納米粒子具有與尺寸相關的特殊物化性質，許多標準的測試方法不適用于其毒性測試，或需要對測試方案進行優(yōu)化。如用于評估基因突變的細菌回復突變實驗由于細菌體積較小（與納米粒子相當），以及細菌細胞壁與人類/哺乳動物細胞膜不同，并不適合于納米粒子遺傳毒性的評價［39-41］。因此，在檢測策略中，建議將哺乳動物基因突變檢測與微核實驗結合起來［42］。此外，還有許多其他檢測方法針對中間終點，如各種類型的DNA損傷和新的標記物，可以檢測遺傳組學或表觀遺傳學的變化。這些標記物可在一定程度上反映包括納米粒子在內的被測試化合物的安全性［43-44］。遺傳毒性評價應采用一體化、多端點實驗方法，如使納米粒子暴露于3D模型，然后用多個熒光探針進行單細胞分析，以確定納米粒分布、ROS誘導、染色體斷裂/丟失的特定染色體序列以及表觀遺傳變化（低甲基化）的標記［45］。同時監(jiān)管機構應制定嚴格的指導方針。在成功改善藥物安全性、功效和質量后，納米鐵材料的進一步開發(fā)和應用會為多種疾病的治療提供新的手段。