食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

◎ 種 婷

（遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 沈陽 110032）

1 蠟樣芽孢桿菌的危害

蠟樣芽孢桿菌是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌，是一種條件致病菌，自然界中廣泛存在，其產(chǎn)生的內(nèi)生孢子對(duì)外界不良環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力，對(duì)高溫、酸堿不敏感[1]。蠟樣芽孢桿菌分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株，不產(chǎn)毒株是一種有益菌，被用于植物種植和動(dòng)物飼養(yǎng)，但產(chǎn)毒株卻給食品安全和人們的身體健康帶來了嚴(yán)重的危害[2-3]。

2017年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生應(yīng)急中心發(fā)布的食物中毒事件數(shù)據(jù)顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)和中毒總?cè)藬?shù)的1.72%（6/348）和3.63%（268/7 389），僅次于細(xì)菌性食物中毒、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌腸毒素，位列第五[4]。2017—2019年，遼寧省共采集12類4 694份樣品進(jìn)行食源性致病菌檢測(cè)分析，蠟樣芽孢桿菌在第二季度檢出率最高為16.92%[5]。2018—2020年，寶雞采集轄區(qū)內(nèi)12個(gè)縣區(qū)6類食品187份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果檢出33株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為17.65%[6]。在腐乳[7]、嬰幼兒食品[8]、蜂蜜[9]、濕粉類制品[10]和米飯和肉制品[11]等食品中均檢出過蠟樣芽孢桿菌。產(chǎn)毒株按照食物中毒癥狀分為嘔吐型和腹瀉型兩種，其分泌的毒素耐高溫、耐高壓，在食品加工過程中不能被分解，人們誤食被其污染的食品會(huì)引起嘔吐或者腹瀉，嚴(yán)重者還會(huì)死亡[12]。由此可見，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌具有重要意義，本文對(duì)檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法進(jìn)行總結(jié)概括，以期為快速檢測(cè)鑒定蠟樣芽孢桿菌提供思路，為食品安全監(jiān)管提供依據(jù)。

2 免疫學(xué)檢測(cè)法

ZHU等[13]研發(fā)出一種快速檢測(cè)肉制品中蠟樣芽孢桿菌的特異性雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。采用辛酸/飽和硫酸銨沉淀法和蛋白A-sepharose柱分別從兔抗血清和小鼠腹水中制備蠟樣芽孢桿菌特異性多克隆抗體（Polyclonal Antibody，pAb）和單克隆抗體（Monoclonal Antibodies，MAB），檢測(cè)限（Limit of Detection，LOD）為9×102CFU·mL-1。樣品中含有多種致病菌時(shí)，該方法能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到蠟樣芽孢桿菌。酶聯(lián)免疫法的優(yōu)點(diǎn)是高通量，但對(duì)底物顏色有要求，否則會(huì)影響結(jié)果判讀。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)法

3.1 實(shí)時(shí)熒光PCR法

楊滴等[14]建立了一種實(shí)時(shí)熒光PCR法，檢測(cè)肉制品中蠟樣芽孢桿菌，通過對(duì)蕈狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等20株細(xì)菌檢測(cè)，特異性良好，蠟樣芽孢桿菌檢出限為1×103CFU·mL-1。HANSEN等[15]提出一種檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌腸毒素編碼基因的方法，該方法檢測(cè)HBL和NHE操縱子基因的6套引物以及用于檢測(cè)BCET的BCET1、BCET3和BCET4引物的PCR分析。

3.2 多重PCR法

劉芳等[16]采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR法設(shè)計(jì)了與腸毒素相關(guān)的三重HBL A、HBL C、HBL D基因，非溶血性腸毒素三重NHE A、NHE B、NHE C基因，嘔吐毒素、腸毒素、細(xì)胞毒素三重CES、ENT FM、BCE T基因檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌毒力基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示特異性較好，檢出限可達(dá)到63 CFU·mL-1。劉秀峰等[17]建立多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的HBL A、HBL C、NHE A、NHE B、CYT K、CER、ENT FM、BCE T基因和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）的CRY基因。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRY基因可作鑒別基因用來區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金蠟樣芽孢桿菌，大大縮短了蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)周期。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

張童等[18]通過對(duì)5組引物進(jìn)行特異性、靈敏度測(cè)試后，選出性能較好的1組引物，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，從而建立一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)牛乳中的蠟樣芽孢桿菌。將蠟樣芽孢桿菌混入牛乳進(jìn)行檢測(cè)，菌量在2.1×102CFU·mL-1時(shí)即可被檢出。徐曉可等[19]建立針對(duì)嘔吐毒素CES B基因檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增法（Loop-mediated Isothermal Amplification ，LAMP），特異性強(qiáng)，靈敏度為5.0×103CFU·mL-1。采用此法檢測(cè)被蠟樣芽孢桿菌污染的食品，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌菌量超過103CFU·g-1時(shí)即可被檢出。賈雅菁等[20]采用實(shí)時(shí)熒光與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的方式，對(duì)蠟樣芽孢桿菌溶血素HBL A基因進(jìn)行鑒定，該方法比普通環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法靈敏度高10倍，靈敏度可達(dá) 8.2 CFU·mL-1。

3.4 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法

ULRICH等[21]等用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)121株芽孢桿菌（m/z為800～1 800 Da）進(jìn)行測(cè)量，使用ClinProTools 3.0統(tǒng)計(jì)軟件和Flex分析軟件（德國(guó)Bruker Daltonics GmbH），評(píng)估兩種特定的生物標(biāo)記物（m/z分別為1 171 Da和1 187 Da），可以區(qū)分嘔吐型和非嘔吐型蠟樣芽孢桿菌，識(shí)別正確率為99.1%。KRZYSZTOF等[22]采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析完整細(xì)胞，對(duì)嘔吐型和非嘔吐型蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行鑒定。34株蠟樣芽孢桿菌嘔吐型菌株和88株非嘔吐型菌株（包括蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、魏氏芽孢桿菌和類霉菌芽孢桿菌）的系統(tǒng)蛋白質(zhì)組聚類顯示，兩組之間的相似性水平為43%，且嘔吐型菌株之間有高度相關(guān)性（相似性為78%）。

4 結(jié)語

蠟樣芽孢桿菌傳統(tǒng)方法檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，檢驗(yàn)過程復(fù)雜煩瑣，且對(duì)檢驗(yàn)員的能力與經(jīng)驗(yàn)要求高。酶聯(lián)免疫吸附法特異性強(qiáng)，高通量，檢測(cè)周期短，所需儀器設(shè)備僅為一般實(shí)驗(yàn)室常備儀器，缺點(diǎn)是不能實(shí)時(shí)檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光PCR操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，由于蠟樣芽孢桿菌毒力基因多，僅對(duì)其中一個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)準(zhǔn)確率低，有假陽性和漏檢的情況。多重PCR可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因，檢驗(yàn)效率高，但易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，造成假陽性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法操作簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)時(shí)要關(guān)注其特異性，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近年來新興的一種以蛋白質(zhì)指紋圖譜為基準(zhǔn)的鑒定方式，具有鑒定時(shí)間短、通量高、后續(xù)費(fèi)用低等特點(diǎn)，但所用儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)其發(fā)展有所制約。以上檢驗(yàn)方法各自有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際檢測(cè)要求選擇合適的檢測(cè)方法，從而使每種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)最大化。