線粒體DNA在消化系惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

王凌霄，王穎佳，楊健，李耀平

0 引言

線粒體DNA（mt-DNA）是一個(gè)由37個(gè)基因、16569個(gè)堿基對(duì)（bp）組成的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子[1]。它包括13個(gè)參與呼吸作用和氧化磷酸化的多肽基因、2個(gè)rRNA和22個(gè)參與線粒體中合成蛋白質(zhì)的tRNAs組成的編碼區(qū)，以及1個(gè)稱為D-loop的非編碼區(qū)，又稱為控制區(qū)，包含復(fù)制起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子[2]。

線粒體是重要的細(xì)胞器之一，負(fù)責(zé)能量的代謝，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化等[3-4]，同時(shí)在活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，這些因素均參與到mt-DNA突變并導(dǎo)致氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）效率降低和ROS生成增加[5]。線粒體由于其基本的生物能量和生物合成功能，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和健康起著至關(guān)重要的作用。mt-DNA編碼了線粒體功能的關(guān)鍵成分，這些突變均參與調(diào)節(jié)線粒體功能。其中，一些影響線粒體ROS生成的mt-DNA突變決定了細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能[6-8]。雖然目前尚不清楚在惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的mt-DNA突變是癌癥發(fā)展的原因還是結(jié)果，但mt-DNA突變可能導(dǎo)致癌癥發(fā)展是有意義的。此外，近期研究表明mt-DNA的有效載量以及完整的線粒體在細(xì)胞間發(fā)生轉(zhuǎn)移對(duì)腫瘤起著重要作用[9]。然而，目前對(duì)mt-DNA在腫瘤惡性增殖過(guò)程中的作用機(jī)制尚不明確，進(jìn)一步研究mt-DNA在惡性腫瘤中的作用機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的癌癥預(yù)測(cè)因子與治療靶點(diǎn)以及改善患者愈后顯得至關(guān)重要。本文旨在對(duì)mt-DNA在消化系惡性腫瘤的機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 mt-DNA在食管癌中的研究

1.1 mt-DNA拷貝數(shù)變化與食管癌

通過(guò)研究mt-DNA拷貝數(shù)與食管癌的臨床病理特征、預(yù)后和惡性潛能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)癌組織的mt-DNA拷貝數(shù)顯著低于非癌組織。切除的癌組織中低mt-DNA拷貝數(shù)與腫瘤浸潤(rùn)的病理深度和病理分期顯著相關(guān)。與mt-DNA拷貝數(shù)較高的患者相比，拷貝數(shù)較低的患者5年總生存率明顯較差。在mt-DNA耗竭的細(xì)胞中通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)減少，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白、zeb-1和CD44 mRNA表達(dá)增加。Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析還顯示，在mt-DNA耗竭的細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白下調(diào)，N-鈣黏蛋白和CD44蛋白上調(diào)。此外，mt-DNA敲低細(xì)胞具有增強(qiáng)侵襲、遷移和球體形成能力，并且在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)了G0/G1期細(xì)胞周期停滯。這些結(jié)果均表明，mt-DNA耗竭的食管細(xì)胞具有間充質(zhì)特征、癌干細(xì)胞性和耐缺氧性，這在癌癥進(jìn)展中起重要作用[10]。最新研究也發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous carcinoma,ESCC）的腫瘤可能通過(guò)p53表達(dá)增加，影響mt-DNA拷貝數(shù)減少，并影響葡萄糖代謝轉(zhuǎn)移的Warburg效應(yīng)[11]，這進(jìn)一步證明低mt-DNA拷貝數(shù)與食管癌進(jìn)程的相關(guān)性。

1.2 mt-DNA突變與食管癌

通過(guò)檢測(cè)食管癌細(xì)胞系和食管癌患者腫瘤組織中mt-DNA的突變，尋找蛋白質(zhì)和核糖核酸編碼基因突變與食管癌的關(guān)系。在三種食管癌細(xì)胞系中有39個(gè)突變；突變頻率最高的基因包括線粒體編碼的MT-CYB、MT-ND5和MT-ND4基因。在30個(gè)食管癌組織中共鑒定出216個(gè)突變，包括182個(gè)蛋白編碼突變，其中MT-CYB和MT-ND5基因表現(xiàn)出較高的突變頻率。研究結(jié)果表明，食管癌細(xì)胞中mt-DNA編碼的基因突變可能參與食管癌的進(jìn)程[12]。

2 mt-DNA在肝癌中的研究

2.1 mt-DNA相關(guān)編碼基因與肝癌

在人類肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）組織中，13個(gè)mt-DNA編碼基因中的11個(gè)顯示出降低的mRNA水平，5個(gè)基因顯示出降低的蛋白質(zhì)水平，包括細(xì)胞色素B（MT-CYB）和細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ（MT-CO2）基因。線粒體基因測(cè)序顯示大量線粒體miRNAs水平異常，在過(guò)度表達(dá)MitomiR-181a-5p后，HCC細(xì)胞中的MT-CYB和MT-CO2水平降低，由電子傳遞鏈維持的線粒體膜電位降低，并伴隨著己糖激酶2和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1的表達(dá)上調(diào)，葡萄糖、乳酸釋放和乳酸脫氫酶（LDH）活性升高。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，MitomiR-181a-5p表達(dá)引起糖代謝重編程，促進(jìn)肝癌腫瘤生長(zhǎng)和早期肺轉(zhuǎn)移[13]。這表明mt-DNA編碼的相關(guān)基因，通過(guò)影響相關(guān)糖代謝的進(jìn)程參與到癌癥發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。

2.2 mt-DNA突變與肝癌

早期研究表明，mt-DNA突變與HCC進(jìn)展高度相關(guān)，HCC的不良預(yù)后很大程度上是由于mt-DNA突變導(dǎo)致的線粒體功能障礙從而誘發(fā)腫瘤的高轉(zhuǎn)移率[14]。在目前的研究中，通過(guò)對(duì)HCC樣本進(jìn)行測(cè)序，確定了mt-DNA的多個(gè)突變，在這些突變中，線粒體編碼的MT-RNR1 G709A被確定為新的潛在候選。MT-RNR1 G709A多態(tài)性是總生存率和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且MT-RNR1 G709A與較短的總生存期和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期均相關(guān)。從機(jī)制上講，MT-RNR1 G709A與己糖激酶2（HK2）的表達(dá)和HCC患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。數(shù)據(jù)表明MT-RNR1 G709A和HK2共同表達(dá)增高是HCC患者的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素。這提示我們mt-DNA的突變可能影響著己糖激酶2的代謝從而與癌癥的預(yù)后發(fā)展高度相關(guān)[15]。

分析HCC和癌旁組織的mt-DNA突變的差異表達(dá)。其中HCC組織的D-loop區(qū)域平均突變數(shù)明顯少于非HCC組織。相比之下，HCC組織中D-loop區(qū)突變的異質(zhì)水平顯著增加，這意味著D-loop區(qū)突變可能在HCC組織中被積極選擇。此外，結(jié)果表明，D-loop區(qū)突變患者的mt-DNA拷貝數(shù)明顯較低，更有可能復(fù)發(fā)。體外實(shí)驗(yàn)證明，HCC細(xì)胞具有D-loop區(qū)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力突變明顯高于沒(méi)有D-loop區(qū)突變的人群。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了mt-DNA D-loop區(qū)突變?cè)贖BV相關(guān)肝癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用，且D-loop區(qū)突變通過(guò)影響mt-DNA拷貝數(shù)從而影響HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，在肝癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用[16]。

2.3 mt-DNA測(cè)序與肝癌

將來(lái)自肝細(xì)胞癌患者和非癌癥患者的血液用于mt-DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)分析表明與HCC關(guān)聯(lián)最密切的mt-DNA多態(tài)性位點(diǎn)分布于各線粒體基因組中，并影響所有線粒體基因。來(lái)自宿主血液中的mt-DNA基因變異體的異質(zhì)性特征，有助于將特定突變與癌癥相關(guān)聯(lián)，從而幫助開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確、快速和微創(chuàng)的癌癥診斷檢測(cè)[17]。

3 mt-DNA在胰腺癌中的研究

研究表明，在胰腺癌中，特定的mt-DNA單倍體突變或單核苷酸多態(tài)性均可能增加患病風(fēng)險(xiǎn)，大量mt-DNA突變可能支持侵襲性表型。因此，mt-DNA的表達(dá)可能代表著不良的預(yù)后因素。這些發(fā)現(xiàn)提示我們，mt-DNA的突變或者被耗竭均有可能促進(jìn)著癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移[18]。但是由于目前關(guān)于胰腺癌的mt-DNA研究報(bào)道較少，尚未表明mt-DNA和胰腺癌有明確的關(guān)聯(lián)性。

4 mt-DNA在膽囊癌中的研究

mt-DNA的D-loop區(qū)D310的插入/缺失在膽囊癌發(fā)病機(jī)制中是相對(duì)頻繁和早期的事件[19]。實(shí)驗(yàn)證明，D310序列突變和其他mt-DNA變化可從消化系惡性腫瘤患者的血液樣本中檢測(cè)到，而在膽囊癌中發(fā)現(xiàn)有38%的D310序列突變，這可能是膽囊癌早期檢測(cè)的潛在有用標(biāo)記，特別是在血清生物標(biāo)志物中，存在TP53突變、遺傳不穩(wěn)定性和基因異常甲基化[20]。這表明mt-DNA可能作為膽囊癌潛在的早期分子標(biāo)志物，便于患者的早期篩查。

5 mt-DNA在胃癌中的研究

5.1 mt-DNA突變與胃癌

在胃癌中mt-DNA D環(huán)的突變主要是同源的，并且經(jīng)常在嘧啶位點(diǎn)轉(zhuǎn)變。過(guò)度激活的DNA修復(fù)功能可能會(huì)修復(fù)胃癌導(dǎo)致的mt-DNA損傷[21]。此外，D環(huán)區(qū)的突變有可能改變mt-DNA和細(xì)胞器本身的功能，編碼基因的突變似乎也對(duì)胃癌的發(fā)生有影響——特別是ND1基因[22]和12S rRNA[23-24]的突變，12S rRNA可能與腸型胃癌的發(fā)生有關(guān)。根據(jù)mt-DNA突變位點(diǎn)的變化將胃癌進(jìn)行分類，可運(yùn)用于患者篩查和治療管理的改變，以及建立更精確的分子標(biāo)志物。因此，使用mt-DNA作為胃癌的腫瘤標(biāo)志物，有希望在患者診斷和治療中應(yīng)用。

5.2 mt-DNA拷貝數(shù)與胃癌

mt-DNA拷貝數(shù)和端粒長(zhǎng)度呈正相關(guān)，且端粒和線粒體功能相關(guān)性的喪失可能導(dǎo)致胃癌發(fā)病機(jī)制的啟動(dòng)或進(jìn)展。因此，我們可以將mt-DNA拷貝數(shù)的變化與端粒的長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)，來(lái)作為推測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，在胃癌患者的診斷和治療中應(yīng)用[25]。但是目前尚無(wú)研究表明mt-DNA拷貝數(shù)變化與胃癌有直接關(guān)聯(lián)，因此，我們可以繼續(xù)進(jìn)行二者關(guān)聯(lián)性的研究。通過(guò)檢測(cè)相關(guān)胃癌患者拷貝數(shù)表達(dá)[26]，發(fā)現(xiàn)mt-DNA拷貝數(shù)減少且攜帶D310突變的胃癌患者預(yù)后生存時(shí)間較短、預(yù)后較差。相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，線粒體DNA拷貝數(shù)減少導(dǎo)致的線粒體功能障礙可誘導(dǎo)葡萄糖利用的代謝重編程，包括糖酵解增強(qiáng)、磷酸化抑制減少，以及AGS胃癌細(xì)胞系中更具攻擊性的表型[27]。綜上所述，mt-DNA拷貝數(shù)的減少在胃癌的癌變、進(jìn)展和不良預(yù)后中起重要作用。

5.3 mt-DNA測(cè)序與胃癌

通過(guò)對(duì)胃癌患者及正常人的mt-DNA測(cè)序，結(jié)果顯示，MT-ND3的rs28358278、rs2853826和rs41467651多態(tài)性增加了胃癌發(fā)生的易感性。其中，在所有年齡段胃癌患者中，rs41467651 T等位基因與胃癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)；在女性受試者中，rs28358278 G、rs2853826 T等位基因與胃癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[28]。此外，相關(guān)測(cè)序表明，MT-RNR1、MT-ND5、MT-ND4、MT-ND2、MT-DLOOP1和MT-CO1等基因在腫瘤組織中的變異系數(shù)更高[29]。這表明mt-DNA與胃癌易感性相關(guān)，并可作為相應(yīng)測(cè)序指標(biāo)，引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。

6 mt-DNA在結(jié)直腸癌中的研究

6.1 mt-DNA相關(guān)編碼基因與結(jié)直腸癌

通過(guò)分析結(jié)直腸息肉、腺癌及其相應(yīng)鄰近正常組織中的電子傳遞鏈、復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ以及羰基蛋白質(zhì)組的含量，結(jié)果表明，mt-DNA基因在結(jié)直腸腫瘤（colorectalcancer,CRC）中的表達(dá)存在差異，腫瘤組織中復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的水平高于鄰近的正常組織。某些mt-DNA基因表達(dá)的增加和ROS水平的升高可能在結(jié)直腸腫瘤從息肉演變?yōu)閻盒圆∽冎衅鹬匾饔肹30]。此外，通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌患者組織樣本中mt-DNA相關(guān)基因COXIV-1和ATPase6表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺瘤性息肉發(fā)展過(guò)程中COXIV-1和ATPase6線粒體蛋白表達(dá)的降低與ROS產(chǎn)生的增加相關(guān)，COXIV-1在結(jié)直腸細(xì)胞從息肉發(fā)展到癌的能量代謝中起著關(guān)鍵作用[31]。將腫瘤組織與鄰近正常組織相比，結(jié)直腸癌和腺癌中MT-COI、MTCYB、MT-ND1和MT-RNR1的表達(dá)水平逐漸升高[32]。因此，線粒體編碼基因的失調(diào)促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展。MT-ND1是mt-DNA中常見(jiàn)的已發(fā)生突變的基因之一，通過(guò)對(duì)MT-ND1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)細(xì)胞mt-DNA總體上呈現(xiàn)出與腫瘤組織的高度一致性，且結(jié)直腸癌患者血漿中MT-ND1含量明顯高于健康人[33]。總之，MTND1的含量和變異體可能成為診斷和監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌的工具，而血液中檢測(cè)相關(guān)mt-DNA可以作為一種新的檢測(cè)方式診斷結(jié)直腸癌。

6.2 mt-DNA拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌

通過(guò)對(duì)CRC樣本分析可得知，更深的腫瘤浸潤(rùn)和更長(zhǎng)的腫瘤長(zhǎng)度均與mt-DNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)，且更高的mt-DNA拷貝數(shù)和線粒體功能可能賦予CRC侵襲性優(yōu)勢(shì)[34]。此外，通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)mt-DNA的拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，呈劑量依賴性，并在隨后5年以上的隨訪中發(fā)現(xiàn)，mt-DNA拷貝數(shù)和結(jié)直腸癌之間的反向關(guān)聯(lián)仍然顯著[35]，這表明，mt-DNA的拷貝數(shù)可能是結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的長(zhǎng)期預(yù)測(cè)因子。

6.3 mt-DNA測(cè)序與結(jié)直腸癌

對(duì)結(jié)直腸癌患者的mt-DNA進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示mt-DNA單倍型M7和單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。其中單倍型M7特異性SNP，包括199T＞C、4071C＞T和6455C＞T，與結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)降低呈正向關(guān)聯(lián)，即M7特異性SNP表達(dá)增加時(shí)，相應(yīng)結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)降低，故而單倍型M7與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)顯著降低有關(guān)。提示我們，結(jié)直腸癌患者存在mt-DNA單倍體M7和SNPs潛在關(guān)聯(lián)[36]。

6.4 mt-DNA突變與結(jié)直腸癌

在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中調(diào)查了mt-DNA的D 環(huán)區(qū)域單核苷酸多態(tài)性的結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)特征，其中D-環(huán)區(qū)mt-DNA多態(tài)位點(diǎn)m.146T＞C、m.324C＞G、m.73G＞A、m.195T＞C、m.16304T＞C和m.16261C＞T均與結(jié)腸癌高危因素相關(guān)[37]，且mt-DNA T4216C突變?cè)谀[瘤患者組織與鄰近正常組織之間存在顯著差異[38]。因此在mt-DNA中尋找體細(xì)胞突變和D環(huán)區(qū)域單核苷酸多態(tài)性將是癌癥早期檢測(cè)的診斷價(jià)值之一。

7 結(jié)論與前景

近年來(lái)，mt-DNA已成為參與癌癥進(jìn)展的重要分子。mt-DNA突變被認(rèn)為能夠適應(yīng)不斷變化的組織或環(huán)境，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，mt-DNA單核苷酸多態(tài)性和突變可作為癌癥的預(yù)測(cè)因子或預(yù)后生物標(biāo)志物。除此之外，相關(guān)研究表明mt-DNA拷貝數(shù)變化[39]、mt-DNA相關(guān)編碼基因改變[40]均可影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展并維持細(xì)胞功能。這些數(shù)據(jù)均得到了流行病學(xué)研究的支持，正如David等在肝癌中的應(yīng)用[17]，我們可以將相關(guān)表達(dá)值的變化作為消化系惡性腫瘤患者診斷和術(shù)后評(píng)估的一項(xiàng)指標(biāo)。有研究揭示通過(guò)干擾相對(duì)的mt-DNA表達(dá)并進(jìn)行免疫抑制和代謝抑制的聯(lián)合治療[41]，可對(duì)個(gè)體的免疫系統(tǒng)激活，提高癌癥治療效果。mt-DNA在消化系惡性腫瘤中起到了重要的作用，但導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確，隨著新型分子生物學(xué)技術(shù)及相關(guān)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展（從基因組學(xué)到轉(zhuǎn)錄組學(xué)，從蛋白質(zhì)組學(xué)到代謝組學(xué)），mt-DNA在癌癥中的研究將會(huì)有更多的突破，并為臨床上的準(zhǔn)確識(shí)別與線粒體功能障礙相關(guān)的特定信號(hào)通路和開(kāi)發(fā)治療干預(yù)措施等方面提供重要的研究?jī)r(jià)值。