奇壬醇對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)制研究進(jìn)展

昌 震，李大同，楊小彬，孔令擘，孫 楊

(1.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院脊柱外科，陜西 西安 710054；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院骨顯微外科，陜西 漢中 723000)

現(xiàn)代研究表明，許多中草藥具有放松關(guān)節(jié)、強(qiáng)化骨骼和肌肉的功能，并可用于治療骨損傷的相關(guān)疾病，如骨質(zhì)疏松癥。天然植物或藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨特異性基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、信號(hào)通路、骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)與核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)受體活化因子受體配體(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)(即OPG-RANKL系統(tǒng))和激素類生物活性物質(zhì)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化。奇壬醇(Kirenol，Kir)是一種天然單體，在一些實(shí)驗(yàn)中顯示其對(duì)破骨細(xì)胞的分化有著抑制作用，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的前瞻性思路?，F(xiàn)就奇壬醇對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 骨質(zhì)疏松癥概述

骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的骨科疾病，其特點(diǎn)是骨量減少與骨組織微結(jié)構(gòu)的退化，極大地增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)。脊柱骨折不僅顯著影響患者的生活質(zhì)量，增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，并且護(hù)理不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致病死率的增加。事實(shí)上，由于壽命延長(zhǎng)和人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率在男性與女性人群中明顯增高[1]。骨質(zhì)疏松癥主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性，包括絕經(jīng)后由于雌激素水平下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松(即絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥)。其次是繼發(fā)性疾病引起的骨質(zhì)疏松癥，這些疾病包括內(nèi)分泌疾病(如皮質(zhì)醇過(guò)多、甲狀腺功能亢進(jìn))、腎臟疾病(如尿鈣重吸收減少)、血液病(如多發(fā)性骨髓瘤和浸潤(rùn)骨的惡性腫瘤等)、自身免疫或風(fēng)濕病(如炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、營(yíng)養(yǎng)不良、吸收不良(乳糜瀉等)等[2]。

骨質(zhì)流失是一個(gè)緩慢的、無(wú)癥狀的過(guò)程，一般很難發(fā)現(xiàn)。因此，骨質(zhì)疏松癥通常在骨折后才被發(fā)現(xiàn)，在早期可以通過(guò)改變生活方式、加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)、戒煙和戒酒來(lái)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[3]。目前，骨質(zhì)疏松癥的一線治療是通過(guò)藥物搭配鈣劑來(lái)補(bǔ)充日常骨骼代謝所需的成分，減輕或延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]?？构琴|(zhì)疏松藥物包括減少骨吸收藥物(如雙膦酸鹽和地諾單抗)和加速骨形成藥物或兩者兼?zhèn)涞乃幬?如特立帕肽或阿帕羅品)，也有研究提出使用雌激素替代療法來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥。這些藥物與治療方法可有效控制骨質(zhì)疏松癥，減少骨折的風(fēng)險(xiǎn)，但長(zhǎng)時(shí)間使用帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)壓力與不良反應(yīng)是人們難以忽略的。盡管雌激素替代療法在改善骨密度和減少絕經(jīng)早期骨折發(fā)生率方面取得了積極的效果，但雌激素替代療法的長(zhǎng)期使用受到潛在并發(fā)癥的限制，如乳腺癌、子宮出血和心血管等。雙磷酸鹽類藥物的長(zhǎng)期服用會(huì)帶來(lái)頜骨壞死的風(fēng)險(xiǎn)。在口服雙磷酸鹽類藥物治療骨質(zhì)疏松癥的患者中，頜骨壞死的發(fā)生率似乎相對(duì)較低，而在接受大劑量靜脈注射雙磷酸鹽的惡性腫瘤患者中則相對(duì)較高[5]。因此，最理想的治療效果是通過(guò)強(qiáng)化骨形成來(lái)加速新骨的形成，糾正骨質(zhì)疏松癥所特有的小梁微結(jié)構(gòu)不平衡，這種骨形成強(qiáng)化劑將為骨質(zhì)疏松癥的治療提供一個(gè)新的選擇[6]。

2 奇壬醇對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)制

骨骼的形成和吸收平衡受多種細(xì)胞信號(hào)、激素和生長(zhǎng)因子的調(diào)控，這些信號(hào)和因子主要受RANKL與OPG的調(diào)節(jié)[7]。RANKL在骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)和前骨細(xì)胞中，并在T細(xì)胞表面高度表達(dá)。當(dāng)RANKL與NF-κB受體活化因子受體(RANK)結(jié)合時(shí)，破骨細(xì)胞的分化和功能就會(huì)增強(qiáng)[8]。除上述途徑外，一些合成代謝信號(hào)途徑也積極參與骨的形成，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、細(xì)胞外因子(Wnt)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)等[9]。Baron等[10]研究表明，Wnt途徑的激活會(huì)增加骨強(qiáng)度和骨密度，而其失活會(huì)增加骨的脆性。Runx2/Cbfa1和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)對(duì)產(chǎn)生骨特異性基質(zhì)蛋白[包括堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)等]的基因調(diào)節(jié)至關(guān)重要，并最終刺激骨結(jié)核的礦化[11]。

Kir是一種具有生物活性的二萜類中草藥，具有抗風(fēng)濕的特性。據(jù)報(bào)道，Kir具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)、抗關(guān)節(jié)炎和抗光老化的活性[12]。此外，它還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[13]。一項(xiàng)骨折愈合實(shí)驗(yàn)研究顯示，Kir的使用可以促進(jìn)骨折愈合，并隨著劑量的增加，促骨愈合的效果越好，這是由于Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑的早期激活與Runx2途徑的持續(xù)活躍加速了骨形成。研究表明，Kir組大鼠在第10天的Wnt3a、β-catenin、T細(xì)胞因子(TCF)、脂蛋白相關(guān)蛋白5(LRP5)和 Runx2的表達(dá)增加量高于對(duì)照組，而在第10～21天對(duì)照組Wnt3a、β-catenin、Runx2和LRP5的表達(dá)增加量高于Kir組，這表明Wnt/β-catenin途徑在骨折愈合的早期階段更加活躍，Kir早期激活Wnt，隨后在鈣化過(guò)程中Wnt活性下降。除了對(duì)Wnt信號(hào)通路的影響外，Kir還增加了Runx2的水平。Kir可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖來(lái)促進(jìn)骨愈合。此外，β-catenin水平的升高和Wnt途徑的激活可能有助于Runx2水平的增加。并且，Kir也可以通過(guò)增加Wnt3a和β-catenin的水平來(lái)激活Wnt途徑，加速成骨細(xì)胞的生成，這種作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)。因此，Kir通過(guò)對(duì)Runx2和Wnt信號(hào)通路的激活促進(jìn)了骨質(zhì)合成與骨愈合，減少了骨流失，這使得其可能可以控制以骨量流失為特征的疾病的進(jìn)展[14]。

破骨細(xì)胞是一種大型的多核巨噬細(xì)胞，通過(guò)分泌抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和蛋白酶來(lái)發(fā)揮骨骼的吸收功能[15]。破骨細(xì)胞的調(diào)控主要依靠RANKL-RANK通路、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白(AP-1)和 Ca2+-活化T細(xì)胞核因子1蛋白(NFATc1)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。研究[17]表明，分別加入 50 μmol/L RANKL和 30 μmol/L 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)可刺激破骨細(xì)胞分化，再加入1.25 μmol/L Kir處理2 h后發(fā)現(xiàn)其對(duì)破骨細(xì)胞的形成具有抑制作用，且無(wú)細(xì)胞毒性；此外，1.25～10 μmol/L的 Kir以劑量依賴的方式明顯減少了破骨細(xì)胞的骨吸收陷凹深度。單核早幼破骨細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞融合的方式形成成熟破骨細(xì)胞，并具有骨吸收功能[18]。融合的多核細(xì)胞形成一個(gè)大的肌動(dòng)蛋白環(huán)(即F-catin)，使其能夠吸收骨質(zhì)[19]。破骨細(xì)胞特異性基因[TRAP、破骨細(xì)胞相關(guān)受體(OSCAR)、組織蛋白酶K(CTSK)、破骨細(xì)胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)、人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和 β3-整合素)]表達(dá)能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。而研究[20]表明1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir能夠抑制破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，包括 TRAP、OSCAR、OC-STAMP、CTSK和MMP-9。

RANK-RANKL信號(hào)通路激活了F-actin的形成，在5 μmol/L Kir的實(shí)驗(yàn)中減少了F-actin的大小和質(zhì)量，干預(yù)和抑制破骨細(xì)胞的形成并削弱了骨吸收的過(guò)程。NF-κB信號(hào)通路在破骨細(xì)胞形成的早期階段起著關(guān)鍵作用，NF-κB抑制因子α(I-κBα)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65作為信號(hào)通路成分更容易被檢測(cè)到。1.25 μmol/L和 5 μmol/L Kir被證明可抑制I-κBα的降解和p65的磷酸化。5 μmol/L Kir對(duì)RANKL誘導(dǎo)的p65細(xì)胞質(zhì)水平的抑制增加了p65的核轉(zhuǎn)位?？傊琄ir抑制了RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活。

除NF-κB外，在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，MAPK途徑誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成。RANKL刺激MAPK中的p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERPK)的磷酸化[21]。研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L Kir能明顯抑制p38和ERPK的磷酸化，但不抑制JNK的激活。激活蛋白-1(Ap-1)是破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MAPKs下游的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而c-Fos是 AP-1復(fù)合物的一個(gè)重要亞單位。研究表明，用RANKL刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞30 min 后，加入Kir可降低 c-Fos基因和蛋白質(zhì)水平。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在 RANKL刺激 24 h后，c-Fos 核蛋白的表達(dá)也被 Kir抑制。

在破骨細(xì)胞中，NF-κB和MAPK/AP-1的激活會(huì)增強(qiáng)NFATc1的核位移，并觸發(fā)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，包括 TRAP、OSCAR、CTSK和β3-整合素，最終誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟和骨吸收。NFATc1是破骨細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，可被 Ca2+振蕩上調(diào)。據(jù)報(bào)道，NFATc1基因敲除的小鼠會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松與骨量降低[22]。RANKL的刺激則可顯著上調(diào)NFATc1基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，NFATc1還受鈣離子內(nèi)流的調(diào)節(jié)[23]。然而，窖蛋白(Cav-1)的缺乏會(huì)使得破骨細(xì)胞在分化過(guò)程中下調(diào)NFATc1和c-Fos的表達(dá)[24]，減少破骨細(xì)胞的生成。Cav-1還增加了Ca2+振蕩的發(fā)生[25]。加入 1.25 μmol/L Kir處理后，NFATc1蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)明顯減少。5 μmol/L Kir則可明顯抑制RANKL刺激下的細(xì)胞Ca2+振蕩，這與它對(duì)NFATc1核轉(zhuǎn)位的抑制作用一致。有研究表明，Cav-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)都可以被5 μmol/L Kir所抑制。因此，Kir在破骨細(xì)胞分化中對(duì) NFATc1的抑制可能是通過(guò)抑制Cav-1表達(dá)、限制Ca2+振蕩來(lái)實(shí)現(xiàn)。

事實(shí)上，腫瘤壞死因子(TNF)在去卵巢(OVX)小鼠中骨流失作用的機(jī)制已經(jīng)得到驗(yàn)證。TNF可以增強(qiáng)RANKL活性，誘導(dǎo)生成Th17細(xì)胞[26]。Th17細(xì)胞可以通過(guò)分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A、RANKL、TNF、IL-1、IL-6以及低水平的γ干擾素(IFN-γ)來(lái)有效地誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成，從而刺激骨吸收。IL-17A刺激包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞釋放RANKL并通過(guò)上調(diào)RANKL活性來(lái)增加破骨細(xì)胞的活性[27]。在患有骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)后婦女的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-17A水平明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過(guò)雌激素受體α(ERα)的介導(dǎo)可以抑制CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞[28]，減少IL-17A的生成。此外，抑制IL-17A受體或使用抗IL-17A抗體都可能有限地減少OVX大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生率[29]。這些研究表明了IL-17A在介導(dǎo)骨質(zhì)流失中的重要性。

在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eEAE)的研究中發(fā)現(xiàn)，Kir可以有效地減少小鼠體內(nèi)IFN-γ的產(chǎn)生，抑制產(chǎn)生IL-17A的CD4+T細(xì)胞的分化，在第25天收集的血清樣本中，與鹽水處理的對(duì)照小鼠相比，使用Kir的EAE小鼠血清中IFN-γ和IL-17A水平明顯降低，這說(shuō)明使用Kir的EAE小鼠體內(nèi)的Th1/Th17等細(xì)胞明顯減少。也有進(jìn)一步研究[30]顯示，Kir以濃度依賴的方式誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞發(fā)生凋亡。在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到CD4+、CD25+、Foxp3+、 IL-4+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增加和IFN-γ+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量的減少。因此，Kir對(duì)TNF-α和IL-17A的產(chǎn)生均有抑制作用。在CIA的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組滑液中TNF-α、IL-17A和IL-6的水平增加，而在Kir或潑尼松龍組中的含量明顯降低。也有研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中，Kir預(yù)處理能明顯改善癥狀，減少結(jié)腸病變，使用Kir明顯降低了小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)IFN-γ、IL-17A、IL-6和TNF-α的分泌，增加了淋巴細(xì)胞的凋亡率，尤其是 CD4+T細(xì)胞。這些研究表明，Kir的作用范圍很廣，對(duì)多種疾病的相似信號(hào)通路都有穩(wěn)定相似的作用。

Kir不僅對(duì)體外抑制破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞功能有積極作用，而且對(duì)OVX引起的骨質(zhì)疏松癥也有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，以2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir喂養(yǎng)OVX小鼠后，將股骨組織切片用HE和TRAP染色定量分析發(fā)現(xiàn)，小鼠BMD、骨小梁數(shù)目與骨小梁體積分?jǐn)?shù)明顯增加，而破骨細(xì)胞覆蓋面面積與骨面比和侵蝕面面積/骨面比都明顯減少，小鼠無(wú)不良反應(yīng)；在使用實(shí)驗(yàn)小鼠的左股骨和脛骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)一步培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，使用 2 mg/kg Kir和10 mg/kg Kir處理能顯著降低破骨細(xì)胞的分化和骨吸收能力。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Kir既可抑制破骨細(xì)胞的形成，也可減輕因雌激素減低而引起的骨質(zhì)疏松癥[31]。

Cav-1是一種位于細(xì)胞膜上的重要結(jié)構(gòu)蛋白，具有膜運(yùn)輸、膽固醇調(diào)節(jié)、內(nèi)吞作用、細(xì)胞生長(zhǎng)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣平衡的功能，被認(rèn)為是控制破骨細(xì)胞分化的一個(gè)功能因子[32]。在OVX小鼠模型組中發(fā)現(xiàn)，Cav-1和 NFATc1 mRNA的表達(dá)升高，但經(jīng)2 mg/kg Kir與10 mg/kg Kir處理后，其水平在體內(nèi)明顯降低，而且破骨細(xì)胞中的特異性基因(如 TRAP、ATP6v0d2和CTSK)明顯減少，這表明Kir在體外和體內(nèi)都能夠抑制破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中Cav-1和NFATc1的表達(dá)。

3 結(jié) 語(yǔ)

骨質(zhì)疏松癥是一種多因素導(dǎo)致的骨質(zhì)流失疾病，大大增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)。Kir作為具有生物活性的二萜類化合物，能夠通過(guò)抑制多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制破骨細(xì)胞的活性，以減少骨破壞和吸收，同時(shí)通過(guò)積極的途徑激活破骨細(xì)胞的生成以保持健康的骨量。Kir能抑制和屏蔽與各種骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的細(xì)胞，進(jìn)一步降低骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防OVX誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥。Kir為骨質(zhì)疏松癥等破骨細(xì)胞相關(guān)骨骼疾病的潛在治療方法提供了有利的選擇。