細(xì)胞因子在新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性中的作用研究進(jìn)展

黨美佳，張小用，李 靜

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068；3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是常見的視網(wǎng)膜變性疾病，可導(dǎo)致老年患者不可逆的中心視力喪失，是造成全世界老年人群發(fā)生不可逆性盲的主要原因。早期AMD臨床癥狀有玻璃體和視網(wǎng)膜色素上皮的異常。晚期AMD可以是非新生血管性(也稱為萎縮性、干性或非滲出性)或新生血管性(也稱為濕性或滲出性)[1-2]。新生血管性AMD(Neovascular age-related macular degeneration，nAMD)以黃斑區(qū)脈絡(luò)膜新生血管(CNV)、視網(wǎng)膜色素上皮脫離、黃斑區(qū)水腫和出血為主要特征[2]。晚期AMD可導(dǎo)致嚴(yán)重的永久性視力損害和失明，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和功能獨(dú)立性。nAMD發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前認(rèn)為與患者的年齡、遺傳、吸煙、氧化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)老化和代謝異常等多因素綜合作用有關(guān)[3]。細(xì)胞因子是一類在細(xì)胞信號傳遞過程中具有生物學(xué)活性的重要小分子多肽或糖蛋白，主要包括白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生長因子(GF)和趨化因子(CK)等。大量研究表明nAMD患者眼內(nèi)多種細(xì)胞因子升高，細(xì)胞因子作為免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)在nAMD發(fā)病機(jī)制中起重要作用?，F(xiàn)就這些細(xì)胞因子在nAMD中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為nAMD的治療提供更多的思路和選擇。

1 白細(xì)胞介素

IL由白細(xì)胞產(chǎn)生，又可作用于多種細(xì)胞，在激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化，參與造血、傳遞信息，以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。Sakurada等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1α和IL-15在nAMD中的濃度均顯著高于白內(nèi)障，這一趨勢在缺血/再灌注損傷大鼠模型的血漿中也觀察到。已有研究證實(shí)了AMD的RPE細(xì)胞中PYD結(jié)構(gòu)域包含蛋白3(NLRP3)炎癥小體的激活，IL-1α被認(rèn)為啟動(dòng)了視網(wǎng)膜中NLRP3炎癥小體的組裝，在RPE細(xì)胞中使用IL-1α啟動(dòng)炎癥小體增加了RPE細(xì)胞對光氧化損傷介導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞死亡的敏感性，并將誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制從凋亡改變?yōu)榧?xì)胞焦亡。這一過程可能促進(jìn)了AMD的RPE變性[5]。由于RPE細(xì)胞死亡是AMD進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)，IL-1α已被認(rèn)為是控制無菌視網(wǎng)膜炎癥的治療靶點(diǎn)。

IL-18在AMD發(fā)病中的作用尚不清楚。Doyle等[6]證明IL-18前體誘導(dǎo)RPE細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而，將活性形式的IL-18注射到小鼠視網(wǎng)膜中并沒有對組織造成損害。這與他們最初的發(fā)現(xiàn)一致，單獨(dú)注射IL-18或聯(lián)合抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)治療減少了激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中的新生血管，IL-18在血管生成和新生血管形成中的作用已得到證實(shí)[7]。這些研究結(jié)果表明IL-18對nAMD有保護(hù)作用。關(guān)于此觀點(diǎn)，不同的研究說法不一。Tarallo等[8]報(bào)道，AMD患者捐贈(zèng)的眼睛中Disher酶的表達(dá)減少，由于Alu RNA的積累，這種酶的減少足以誘導(dǎo)RPE損傷，該小組證明了Alu誘導(dǎo)的RPE毒性依賴于NLRP3炎癥小體成分的表達(dá)，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和人細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(PYCARD)。為了驗(yàn)證IL-18的保護(hù)作用假說，這個(gè)小組給缺乏Caspases-1的小鼠注射了IL-18，發(fā)現(xiàn)仍然引起了類似于Alu RNA積累的RPE損傷。多項(xiàng)研究[9-10]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體是AMD發(fā)生的中心。炎癥小體通過將兩種主要的促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18從不活躍的前體細(xì)胞裂解成為成熟的細(xì)胞因子來控制它們的成熟?？刂蒲装Y小體的激活實(shí)際上是控制AMD中IL-18的水平，從系統(tǒng)上看它是nAMD疾病進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)。

Mimura等[1]研究表明，nAMD組房水中IL-6和IL-8平均水平大約是白內(nèi)障組的2～4倍。Seddon等[11]研究證明IL-6升高可能作為nAMD進(jìn)展的標(biāo)志。IL-6和IL-8是巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子，主要參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期應(yīng)答、抗感染免疫等功能，特別是在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[12]。IL-6是引起內(nèi)皮通透性增加的重要介質(zhì)，可以通過內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改變和肌動(dòng)蛋白絲的重排來誘導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性的增加。研究[13-14]顯示IL-6對于脈絡(luò)膜血管生成既是必要的，也是充分的，它可通過IL-6R和巨噬細(xì)胞的經(jīng)典激活刺激脈絡(luò)膜血管生成，然后刺激血管生成。然而，Klein等[15]發(fā)現(xiàn)血漿IL-6水平與nAMD進(jìn)展間沒有顯著聯(lián)系。Sato等[16]研究則認(rèn)為IL-6水平是nAMD進(jìn)展的負(fù)性因素。

Mimura等[1]研究表明nAMD患者房水中IL-8濃度較健康對照組顯著升高。IL-8在多種視網(wǎng)膜疾病中發(fā)揮著重要的作用，對中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞有強(qiáng)大的趨化和激活作用。此外，IL-8能夠促進(jìn)黏附分子表達(dá)，在新生血管形成中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大部分IL-8都聚集在RPE的脈絡(luò)膜面，IL-8基因可能是參與AMD發(fā)展的重要基因。

2 干擾素

IFN是內(nèi)源性細(xì)胞因子，表現(xiàn)出有效的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗增殖特性。IFN-α和IFN-γ有促炎作用，而IFN-β主要作用是免疫調(diào)節(jié)。Afarid等[17]研究發(fā)現(xiàn)，nAMD患者血清IFN-β水平高于干性AMD。IFN受體激活可以誘導(dǎo)典型的JAK-STAT或替代信號通路，它們的協(xié)同作用導(dǎo)致多效性細(xì)胞反應(yīng)，從而產(chǎn)生不同的生物反應(yīng)。替代補(bǔ)體途徑、免疫細(xì)胞激活和自身免疫都是現(xiàn)已證實(shí)的nAMD重要的相關(guān)發(fā)病機(jī)制。有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，IFN-β對小膠質(zhì)細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用，可對抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫[18]。在nAMD的發(fā)展過程中，人補(bǔ)體因子H(CFH)在RPE細(xì)胞中過度表達(dá)可趨化單核細(xì)胞并誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的趨化性遷移，是重要的免疫相關(guān)因素。IFN可顯著上調(diào)RPE細(xì)胞中CFH的表達(dá)，IFN-β給藥在nAMD的激光模型中發(fā)揮了積極的治療效果，有效地減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的反應(yīng)以及CNV的形成。Mo等[19]研究表明，IFN-γ可以過度表達(dá)IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP10)作為AMD的生物標(biāo)志物。

如今，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)被認(rèn)為是導(dǎo)致CNV進(jìn)展的因素。Sun等[20]研究表明，某些類型的IFN可以抑制VEGF的產(chǎn)生，視網(wǎng)膜中缺乏IFN信號可加速單核吞噬細(xì)胞反應(yīng)并促進(jìn)CNV。因此，IFN-γ可能對nAMD的進(jìn)展產(chǎn)生重要影響。

3 腫瘤壞死因子

TNF是一種多效性促炎細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌。已觀察到可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ(sTNFRⅡ)和TNF-α間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，血漿中sTNFRⅡ水平隨著TNF-α水平的升高而升高。目前尚不清楚sTNFRⅡ是通過充當(dāng)誘餌受體來抑制TNF-α功能，還是通過穩(wěn)定血漿中不穩(wěn)定細(xì)胞因子來促進(jìn)TNF-α功能，從而導(dǎo)致持續(xù)的全身活動(dòng)。IFN和TNF在體外誘導(dǎo)趨化因子、補(bǔ)體和VEGF上調(diào)。研究[21]表明TNF-α改變了RPE的VEGF分泌，TNF-α降低高極化RPE細(xì)胞中的VEGF分泌，但增加與c-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB (NF-κB)通路間的串?dāng)_相關(guān)的非極化RPE細(xì)胞中的VEGF分泌。這表明，在健康RPE中TNF刺激可防止CNV，但在受損RPE中TNF刺激可增強(qiáng)VEGF誘導(dǎo)的滲出過程。與此一致的是，CNV的存在與循環(huán)單核細(xì)胞中TNF-α含量較高有關(guān)。在CNV動(dòng)物模型和nAMD人體組織中觀察到巨噬細(xì)胞活化和M1表型極化，這也與高水平的TNF-α有關(guān)。鑒于早期nAMD中sTNFRⅡ的增加反映了TNF-α分泌的增加，這也與Faber C等的研究結(jié)果一致。nAMD患者血漿中sTNFRⅡ水平的升高是RPE和外周免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果，T淋巴細(xì)胞可以代表這種免疫細(xì)胞，因?yàn)橐阎@些細(xì)胞與RPE相互作用并分泌TNF-α。

4 集落刺激因子

促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，傳統(tǒng)上認(rèn)為它只在體內(nèi)產(chǎn)生紅細(xì)胞。然而，隨著視網(wǎng)膜層中EPO和EPO受體(EPOR)的發(fā)現(xiàn)，EPO似乎在眼睛中也具有生理作用。有研究[22]觀察到EPO通過一種獨(dú)立機(jī)制與VEGF一樣有效地刺激血管生成，無論VEGF的誘導(dǎo)如何。在眼部，高水平的VEGF可由缺血、缺氧或高血糖引起，導(dǎo)致血管滲漏和新生血管形成，這在眼部疾病(如糖尿病視網(wǎng)膜病變和AMD)中非常明顯。因此，在DR和AMD患者中，以VEGF為靶點(diǎn)管理視網(wǎng)膜新生血管一直是減少糖尿病黃斑水腫和脈絡(luò)膜新生血管的策略。然而研究[22]表明，VEGF本身并不能完成血管生成，因此尋找其他同樣有助于血管生成的因子已經(jīng)揭示了EPO的參與。在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的激活可引起血管生成，并促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。同時(shí)，EPO的調(diào)節(jié)也由HIF-1α的控制介導(dǎo)[23]。因此，EPO與EPOR的結(jié)合可能具有誘導(dǎo)新生血管形成的潛力。也有研究證實(shí)EPO通過抑制Caspase來保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞免受光、缺氧、高氧和過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并通過VEGF和血管緊張素途徑上調(diào)血管生成反應(yīng)。視網(wǎng)膜中EPO的表達(dá)以及隨后的絲/蘇/酪氨酸激酶磷酸化可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)分子水平上對細(xì)胞凋亡和血管生成的雙重作用[22]。

Schwarzer等[24]研究發(fā)現(xiàn)，集落刺激因子-1受體(CSF-1R)抑制劑PLX5622對CSF-1R的抑制導(dǎo)致CNV的更快消退。另外，研究顯示CSF-1誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生VEGF和血管生成活性，抑制CSF-1R可降低VEGF水平。因此，阻斷受體可能影響由表達(dá)CSF-1R的細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成。

5 生長因子

有研究發(fā)現(xiàn)AMD患者眼房水VEGF、VEGF受體(sVEGFR-1和sVEGFR-2)水平顯著高于白內(nèi)障對照眼。在nAMD患者中，新生血管從脈絡(luò)膜生長到視網(wǎng)膜下區(qū)域。這些與CNV相關(guān)的異常血管具有多孔壁，與視網(wǎng)膜下出血或液體滲漏相關(guān)。VEGF已被確定為AMD中CNV發(fā)展的關(guān)鍵分子，這一點(diǎn)在兔CNV形成中也已被證實(shí)[1，25]。在培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGFR-1和VEGFR-2的激活通過降低閉合蛋白水平導(dǎo)致緊密連接中斷，因此VEGF受體信號通路在血-視網(wǎng)膜屏障功能障礙的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF誘導(dǎo)sVEGFR-2磷酸化和下游信號級聯(lián)的激活，包括蛋白激酶C-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2。此外，抑制VEGF-VEGFR-2信號傳導(dǎo)可阻止視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白[包括閉鎖小帶-1(ZO-1)、ZO-2和閉合蛋白]的丟失，并防止血-視網(wǎng)膜屏障被破壞。在動(dòng)物模型中，局部或全身使用低分子量VEGFR-2/Src激酶抑制劑可防止VEGF誘導(dǎo)的血管通透性增加，阻斷血管生成，并減少視網(wǎng)膜水腫。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)家族成員具有多效性，在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞方面可能具有不同的作用，它們的促血管生成和抗血管生成作用依賴于環(huán)境。Tosi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，nAMD患者房水中TGF-β1濃度明顯高于白內(nèi)障對照組，表明TGF-β1參與nAMD的形成。已證明生理?xiàng)l件下TGF-β2在房水中表達(dá)，通過對量化激活的TGF-β2和TGF-β2的總蛋白濃度進(jìn)行研究，證實(shí)了Bai等的研究數(shù)據(jù)[27]。他們記錄到nAMD患者玻璃體TGF濃度增加，在人類手術(shù)切除的CNV組織中也記錄到TGF-β表達(dá)增加[28]。它不僅通過RPE誘導(dǎo)VEGF-α表達(dá)，而且其直接和間接抑制作用也與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、RPE細(xì)胞衰老以及阻斷CNV有關(guān)[29]。然而，研究[30]表明TGF-β在眼中可作為抗血管生成因子并保護(hù)RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。

6 趨化因子

趨化因子由組織細(xì)胞和白細(xì)胞產(chǎn)生，結(jié)合到與其連接的G蛋白偶聯(lián)受體上可引起細(xì)胞反應(yīng)，如遷移、黏附或趨化。趨化因子根據(jù)其氨基端(N端)半胱氨酸的排列方式，可分為CXC、CC、XC和CX3C四個(gè)亞族。研究表明趨化因子信號在年齡相關(guān)視網(wǎng)膜疾病中起作用。利用小鼠激光誘導(dǎo)的CNV模型對RPE細(xì)胞中趨化因子表達(dá)進(jìn)行研究，微陣列分析顯示CXCR3表達(dá)增加，表明某些趨化因子/趨化因子受體與CNV有關(guān)[31]。

單核細(xì)胞是趨化因子的代表，炎癥發(fā)生時(shí)單核細(xì)胞被募集到血管炎癥部位，這些細(xì)胞可能有助于血管生成和傷口愈合。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是一種有效的趨化因子，在健康視網(wǎng)膜中表達(dá)較少。然而，在血管生成的早期階段,損傷模型如激光誘導(dǎo)了依賴于CCL2/CCR2途徑的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的遷移和浸潤，從而導(dǎo)致光受體的MORT(一種死亡域蛋白，促進(jìn)Fas蛋白所在細(xì)胞的凋亡發(fā)生)激活，促進(jìn)CNV的進(jìn)展。研究[1]發(fā)現(xiàn)nAMD患者房水中和血清中的MCP-1濃度明顯高于對照組。此外，nAMD患者的眼內(nèi)MCP-1濃度與黃斑厚度和黃斑水腫嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明，MCP-1直接負(fù)責(zé)CNV和AMD周圍的成膜。利用人類細(xì)胞進(jìn)行的體外研究[32]表明，MCP-1由視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞和RPE細(xì)胞組成性表達(dá)，其分泌被其他促炎分子增強(qiáng)。從小鼠RPE細(xì)胞釋放的MCP-1在體外激活小鼠眼巨噬細(xì)胞，并可消化RPE和基底膜中的纖維連接蛋白。

7 結(jié) 語

目前的研究表明，多種細(xì)胞因子在眼內(nèi)表達(dá)增加，這些細(xì)胞因子可能影響nAMD各個(gè)階段的進(jìn)程。在nAMD的進(jìn)展中，這些細(xì)胞因子的作用可能是可變的，而且有時(shí)是相反的。需要進(jìn)一步的研究來了解細(xì)胞因子在nAMD發(fā)病機(jī)制中的作用，以及它們?nèi)绾闻cnAMD中其他重要因素相互作用，如氧化損傷、補(bǔ)體激活、細(xì)胞死亡和血管生成。以這些細(xì)胞因子及受體為靶點(diǎn)可能成為發(fā)現(xiàn)新的疾病途徑和治療方法的關(guān)鍵。