Parkin及其底物在線粒體功能障礙相關疾病中的研究進展

張曉放，陳士玲，蘆小單

(1.長春中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，長春 130117； 2.吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學診治實驗中心，長春 130021；3.長春師范大學生命科學學院，長春 130032)

線粒體功能障礙是神經(jīng)退行性疾病、肥胖、糖尿病以及腫瘤等重大慢性病的發(fā)病基礎。Parkin作為E3泛素連接酶在細胞質中處于自抑制狀態(tài)，但在環(huán)境變化引起線粒體自噬的情況下，細胞質中的Parkin被激活并被招募到線粒體上，通過人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導的激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin途徑介導細胞線粒體自噬，促進線粒體質量控制[1-3]。Parkin蛋白是一個多功能的蛋白，除了泛素連接酶的作用外，還具有轉錄調節(jié)因子的功能，且在不同的疾病中功能不同。目前，神經(jīng)退行性疾病帕金森病(Parkinson′s disease，PD)的病因及發(fā)病機制一直是科學研究的熱點，以往認為，PINK1/Parkin介導的線粒體自噬途徑損傷是其主要原因[4]。近年在PD患者大腦病變相關的路易小體中發(fā)現(xiàn)，Parkin活性受損，從而導致其底物蛋白[氨?；D運RNA合成酶復合物相互作用多功能蛋白2(aminoacyl transfer RNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2，AIMP2)]蓄積，提示AIMP2作為Parkin的作用底物與路易小體包涵體的形成相關，故開發(fā)靶向AIMP2聚集的化合物可能具有治療PD的潛力[5-6]。此外，Parkin參與線粒體的選擇性降解，在青光眼的研究中發(fā)現(xiàn)Parkin對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞起到保護作用[7]。在肥胖與糖尿病中，過量的葡萄糖會發(fā)生氧化應激，誘導線粒體DNA病變，線粒體自噬減少。研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪甲苷、線粒體抗氧化劑可調節(jié)PINK1/Parkin的表達，逆轉高血糖誘導的線粒體異常狀態(tài)[8]。在腫瘤的研究中，Parkin除了抑制絲氨酸合成及糖酵解途徑外，對腫瘤的生長也具有抑制作用[9-10]。在PARK2基因突變或缺失導致的疾病中，因Parkin缺乏導致其相應的作用底物異常積累?，F(xiàn)就Parkin及其底物在線粒體功能障礙相關疾病中的研究進展予以綜述。

1 Parkin概述

1.1Parkin的結構 1998年在研究常染色體隱性遺傳的PD時，研究者發(fā)現(xiàn)了Parkin基因，并將其命名為PARK2[11]。PARK2位于第6號染色體長臂第2區(qū)第5條帶的第2個亞帶到第7條帶，包含12個外顯子，長度約為1.5 Mb[1]。Parkin蛋白由465個氨基酸組成，分子量為52 000，廣泛表達于各種組織，最初有關其在大腦與肌肉組織中的研究較多，近年學者們開始關注其在脂肪組織與心臟組織中的功能[2]。在未激活狀態(tài)下，Parkin由六部分組成：N端類泛素Ubl結構域、獨特的RING0結構域、典型的RING1結構域(通常與E2酶結合)、催化結構域RING2、RING1結構域和RING2結構域之間的IBR結構域以及分離IBR結構域和RING2結構域間的阻遏子REP區(qū)域[12]。

1.2Parkin的底物 近年來，關于細胞自噬和線粒體自噬的研究廣泛開展。研究發(fā)現(xiàn)，通過線粒體外膜蛋白泛素化降解誘發(fā)線粒體自噬作用的底物主要有線粒體外膜孔蛋白[13-14]、線粒體前體蛋白導入受體TOMM70A、線粒體融合蛋白1/2、線粒體裂變蛋白FIS1、動力蛋白相關蛋白1、線粒體外膜蛋白mitoNEET、己糖激酶1和2、線粒體Rho GTP酶1、Bcl-2相關X蛋白等[15]。Hattori和Mizuno[15]對Parkin功能進行研究發(fā)現(xiàn)，其中被Parkin多泛素化降解的底物有電壓依賴性陰離子通道蛋白1、線粒體Rho GTP酶1、線粒體融合蛋白1/2、己糖激酶1等。這些Parkin作用底物主要為線粒體外膜蛋白，但目前關于Parkin與線粒體內膜蛋白作用的研究較少，還有待進一步探索。

1.3Parkin的作用機制 正常生理情況下，Parkin的Ubl結構域和REP連接體在空間上阻礙了RING1結構域上的E2泛素連接酶的結合位點，且催化位點RING2被RING0封閉，使整個Parkin蛋白處于非激活狀態(tài)[16]。在環(huán)境變化引起線粒體自噬的情況下，RING2和E2的活性位點結合，Parkin被激活[17-18]。錨定在線粒體上的PINK1通過磷酸化作用，將激活狀態(tài)下的Parkin招募到線粒體上，啟動線粒體自噬的過程。另外，由于Parkin的結構中含有RING1結構域，故除了與蛋白底物作用外，Parkin還具有DNA結合能力，可以同時表現(xiàn)出轉錄因子和泛素連接酶功能[19]。與此類似，RBCK1(RANBP2-type and C3HC4-type zinc finger containing 1)、E3泛素連接酶RAD18和MDM2(murine double minute 2)三種蛋白也具有直接結合DNA的能力和泛素連接酶的特性[20]。Parkin在缺氧的環(huán)境下會被招募至細胞核，與轉錄因子雌激素相關受體α相互作用以增強其轉錄活性，以直接或間接的方式調控機體能量和代謝過程。同時，Parkin表達增加能夠保護細胞線粒體毒物、內質網(wǎng)應激和蛋白毒性應激等誘導的細胞死亡[19]。在調節(jié)線粒體自噬的基礎上，Parkin可能具有更加復雜多樣的功能。在氧化應激、缺氧、線粒體DNA損傷等不同條件下，Parkin可能通過不同方式介導細胞器維持或降解的過程[12]，因此未來的研究需更加關注細胞和體內的生理應激源。

2 Parkin與線粒體功能障礙相關疾病

2.1Parkin與PD PD是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，由大腦黑質致密部多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性缺失引起，以形成細胞內的蛋白質包涵體為病理特征[21]。有學者對PARK2基因突變患者的神經(jīng)元模型進行研究發(fā)現(xiàn)，PARK2基因突變與線粒體DNA穩(wěn)態(tài)的受損相關[4]。目前，研究正在探索靶向特定PARK2基因突變誘導的功能障礙的治療方法。一種線粒體的小分子激活劑正在臨床前開發(fā)中，它能夠直接激活Parkin/PINK1或抑制泛素特異性蛋白酶30[22]。有研究認為，由于PARK2基因突變的PD患者中以青少年較為多見，且合并癥的發(fā)生率較低，在治療上更適合選用多巴胺能細胞替代療法[23-24]。在PD患者大腦中還發(fā)現(xiàn)，形成路易小體的α-突觸核蛋白聚集與AIMP2相關，AIMP2作為Parkin的賴氨酸48泛素底物，被多聚泛素化[5]。因此，在關于路易小體形成的研究中，將AIMP2與PD的病理聯(lián)系確定為該蛋白作為Parkin的毒性底物在PD患者大腦中積累。且Parkin活性受損，導致其底物蛋白AIMP2蓄積，而液泡分揀蛋白35調節(jié)AIMP2的溶酶體降解，因而液泡分揀蛋白35的活性可能是防止AIMP2異常蓄積及其與α-突觸核蛋白共聚集的關鍵[5]。Lee等[25]通過實驗證明，成年小鼠Parkin的缺失可能會觸發(fā)γ-突觸核蛋白的聚集并伴隨AIMP2的積累，隨后被重新分配到不溶性隔室中，但是在發(fā)育過程中的某些綜合機制可能掩蓋了PD的病理表現(xiàn)，因為在成年小鼠中Parkin缺失會導致進行性多巴胺能神經(jīng)元丟失。這些體內研究表明，衰老或其他疾病過程可能通過影響蛋白質質量控制或其他調節(jié)γ-突觸核蛋白穩(wěn)定性的信號轉導通路共同促進γ-突觸核蛋白的聚集。而抑制AIMP2聚集的化合物可能在調節(jié)PD中AIMP2-α-突觸核蛋白的聚集方面作為治療安全有效的靶點[6]。同時，AIMP2在臨床疾病診斷方面也發(fā)揮重要作用，Kim等[7]首次提出，Parkin和AIMP2的信使RNA表達水平可作為診斷PD的潛在生物標志物。

因此，線粒體自噬功能障礙在PD發(fā)病機制中起重要作用，而Parkin作為線粒體自噬途徑的關鍵調節(jié)因子，以PINK1/Parkin泛素化降解途徑為中心對Parkin及其底物進行研究對于了解PD的病理機制、早期診斷以及治療靶點的選擇具有重要意義。

2.2Parkin與肥胖及糖尿病 2型糖尿病是一種慢性多系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為胰島素抵抗和(或)胰島素分泌不足。盡管線粒體功能障礙在糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)生中至關重要，但與癌癥和神經(jīng)退行性疾病相比，其在糖尿病腎病中的機制研究更深入[4，10，26]。與其他腎臟結構相比，腎臟的近曲小管中存在的線粒體數(shù)量較多，近曲小管對ATP的依賴性較大，由于腎臟對線粒體的依賴性更高，成為功能最活躍、能量依賴的器官之一[27]。除了線粒體的功能和形態(tài)變化外，糖尿病腎臟顯示出功能失調線粒體的積累，這表明負責線粒體質量控制的機制失調，導致線粒體清除受損或異常線粒體的產(chǎn)生，因此控制線粒體平衡的機制在糖尿病腎病的管理中可能發(fā)揮關鍵作用[28]。在高血糖情況下，過量葡萄糖發(fā)生氧化還原反應，導致線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ的電子泄漏，線粒體復合物Ⅰ和Ⅲ被認為是線粒體中活性氧類的主要來源，而活性氧類的累積效應破壞了線粒體的抗氧化功能，導致氧化應激[29]。同時，活性氧類進一步導致核轉錄因子紅系2相關因子2活化并易位至細胞核，與抗氧化反應元件結合，引起編碼線粒體超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等的基因轉錄水平上調，影響氧化還原狀態(tài)，因此核轉錄因子紅系2相關因子2降解導致高血糖腎近曲小管細胞線粒體去極化和葡萄糖攝取受損[30]。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性線粒體功能障礙和葡萄糖誘導的線粒體DNA改變導致糖尿病腎病[29]。所以，線粒體分裂受損、線粒體生物合成受阻和能量缺乏是糖尿病腎病期間線粒體自噬減少的指標。傳統(tǒng)中藥黃芪甲苷可以改善線粒體質量控制，對2型糖尿病繼發(fā)的糖尿病腎病具有腎臟保護作用。有學者發(fā)現(xiàn)，對db/db糖尿病模型小鼠給予黃芪甲苷可抑制線粒體動力相關蛋白1、線粒體裂變1和線粒體融合素基因2的表達，并下調PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，防止糖尿病腎病進展[8]。另外，通過腹膜內注射線粒體抗氧化劑可提高核轉錄因子紅系2相關因子2活性和PINK/Parkin的表達水平，逆轉高血糖誘導的線粒體異常狀態(tài)，恢復db/db小鼠腎小管細胞的缺陷性線粒體自噬[31]。

Parkin突變或缺乏與PD的遺傳性和散發(fā)性形式有關，在PD人群中2型糖尿病的發(fā)病率更高。有遺傳數(shù)據(jù)表明，PD與2型糖尿病之間存在關聯(lián)[32-33]。Parkin是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的關鍵因素之一，Parkin功能缺失會導致胰島β細胞中胰島素產(chǎn)生和分泌受損，以及對鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病敏感性增加[33]。在脂肪組織研究中發(fā)現(xiàn)，Parkin介導的線粒體自噬在體內米色脂肪細胞的維持中起重要作用，在PARK2基因敲除小鼠的白色脂肪組織中，CL316,243刺激能夠生成富含線粒體的米色脂肪，但由于在此狀態(tài)下線粒體降解途徑受到抑制，米色脂肪不能向白色脂肪轉變[34-35]。在誘導分化的脂肪細胞中，激活蛋白激酶A信號能夠顯著降低羰基氰化物間氯苯腙誘導線粒體招募Parkin的效率，這一過程是通過對Parkin的磷酸化作用進行調控，且不依賴于線粒體解偶聯(lián)蛋白1的表達[34]。在糖尿病環(huán)境中，線粒體動力學的微調平衡受到干擾，在糖尿病腎臟中，功能失調的線粒體異常積累加重。這種功能失調線粒體的積累表明，線粒體自噬受損或該過程不能滿足受損線粒體的清除。因此，需對影響線粒體自噬促進質量控制的因素和在糖尿病環(huán)境中改變引起線粒體功能受損的通路進行研究。關于Parkin機制的研究，對于肥胖和2型糖尿病治療靶點的選擇具有重要意義。

2.3Parkin與腫瘤 細胞需要產(chǎn)生能量來維持生命，癌細胞的快速增長和增殖對能量的需求較大。以往研究表明，Parkin蛋白對多種腫瘤具有抑制作用[36]，但目前文獻報道許多癌癥與Parkin基因突變相關[26]。來自cBioportal(http://www.cbioportal.org)的數(shù)據(jù)庫分析表明，Parkin基因突變率在宮頸癌中約為5%，在肺鱗癌中約為5%，在結直腸癌中為2%～6%[26]。PARK2基因的缺失或突變常發(fā)生在肺癌中，PARK2的失活導致肺癌的發(fā)病率增加。通過分析癌癥基因組圖譜發(fā)現(xiàn)，約1/4的膠質母細胞瘤樣品具有Parkin基因的雜合或純合缺失和點突變[26]。在乳腺癌中，同樣觀察到Parkin的雜合性缺失和拷貝數(shù)缺失[10]。近年研究表明，代謝關鍵酶——磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH)在某些類型的癌癥中常過表達，其過表達可以激活絲氨酸合成以促進癌癥進展[37-38]。Liu等[37]發(fā)現(xiàn)，Parkin是PHGDH的E3泛素連接酶。Parkin在賴氨酸330處泛素化PHGDH，導致PHGDH降解以抑制絲氨酸合成和腫瘤發(fā)生[35]。大量研究表明，Parkin作為腫瘤抑制因子，其在許多癌癥(包括40%～70%的乳腺癌和超過30%的肺癌)中的表達被下調，而這種下調可能是由不同的機制引起，包括雜合性喪失、拷貝數(shù)丟失和啟動子高甲基化PARK2[36，39-40]。除了抑制絲氨酸合成外，研究還顯示，Parkin可抑制糖酵解[9-10]。但Parkin在抑制糖酵解中的功能機制尚不清楚，這可能與其在缺氧誘導因子-1α泛素化中的活性以及對磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號的抑制有關[10，39]。以上研究表明，Parkin在調節(jié)細胞代謝中的作用有助于抑制腫瘤發(fā)展。未來，PHGDH抑制劑的開發(fā)對Parkin缺乏相關的癌癥具有潛在的治療意義。

3 小結與展望

Parkin作為HECT結構域E3泛素連接酶，正常生理情況下處于自抑制狀態(tài)。隨著代謝生物學的迅速發(fā)展，Parkin作為調控線粒體自噬的關鍵調節(jié)因子在肥胖、糖尿病、腫瘤等代謝性疾病中也受到越來越多的關注。在Parkin的結構域中，對RING1和Ubl結構域的研究較為深入，當Ubl結構域受到磷酸化激活時，Parkin才具有泛素連接酶的催化作用和轉錄因子的調控作用。在未來的研究中，揭示Parkin其他4個結構域的功能及作用機制將會對重大慢性病治療起到重要的推動作用。此外，研究轉錄因子參與調控Parkin表達、線粒體蛋白介導的PINK1/Parkin參與線粒體自噬以及Parkin參與線粒體和內質網(wǎng)互作的機制，能夠揭示生命能量代謝的時空網(wǎng)絡調控過程，并在神經(jīng)和代謝性疾病的診斷與治療中發(fā)揮重要作用。