基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對舒肝寧注射液抗炎保肝作用的機制研究

辛 寶，解方園，姚 晨，葛繼蕓，劉 靜，張 菁，繆 宏，黃婷婷，黃玉鳳 （海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥材科, 上海 200438）

舒肝寧注射液是在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)經(jīng)典方劑——張仲景《傷寒雜病論》“茵陳蒿湯”基礎(chǔ)上進一步研發(fā)的純中藥注射劑，由茵陳、梔子、黃芩、板藍根和靈芝等五味中藥材的提取物組合而成，在臨床上主要用于治療急慢性病毒性肝炎、藥物性肝炎、膽汁淤積性肝炎等肝臟疾病[1-2]。舒肝寧注射液所含中藥種類繁多，化學(xué)成分復(fù)雜，其改善肝炎的有效成分及相應(yīng)的作用機制尚不清楚，因此，研究舒肝寧注射液的有效活性成分、作用靶點及其抗炎保肝的作用機制具有重要的科學(xué)意義。

中藥復(fù)方活性成分不明是中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的瓶頸之一，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過將化學(xué)成分映射到疾病基因網(wǎng)絡(luò)中來尋找潛在的生物活性成分，為篩選中藥活性成分提供了一種方法。同時以中藥成分、靶點和疾病等數(shù)據(jù)相關(guān)信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建生物網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)分析闡釋中藥的作用機制，對中藥復(fù)方在臨床應(yīng)用具有重要的意義。

本研究通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻收集舒肝寧注射液的活性成分信息，并在此基礎(chǔ)上利用藥物靶點分析平臺STITCH 預(yù)測舒肝寧注射液可能的作用靶點，采用Cytoscape 構(gòu)建舒肝寧注射液抗肝炎作用的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，對這些靶點進行蛋白-蛋白相互作用分析，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行基因功能和信號通路分析，探討舒肝寧注射液抗炎保肝作用可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 舒肝寧注射液中活性成分的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）以及相關(guān)文獻，分別收集舒肝寧注射液中茵陳、梔子、黃芩、板藍根和靈芝的主要的化學(xué)成分，建立舒肝寧注射液化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，考察化學(xué)成分生物利用度（OB>30%）、藥物相似性（DL>0.18）[3]、化合物含量以及相關(guān)生物功能，通過文獻篩選舒肝寧注射液中有效的活性成分。

1.2 活性成分潛在作用靶點的預(yù)測及篩選

主要通過化合物與蛋白互作數(shù)據(jù)庫（STITCH）進行分析，將活性成分輸入，選擇“人類”物種進行搜索。將搜索得到靶點結(jié)果以TSV 格式進行保存，篩選結(jié)合得分大于0.7 的靶點。以“hepatitis”作為疾病關(guān)鍵詞，搜尋GeneCards 數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫中與肝炎相關(guān)的靶點。將舒肝寧注射液活性成分作用靶點與肝炎相關(guān)疾病靶點取交集，靶點名稱以靶點基因名稱為準，用于后續(xù)靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、基因功能和信號通路分析等工作。

1.3 舒肝寧注射液“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)舒肝寧注射液中主要有效成分作用的肝炎相關(guān)靶點，建立活性成分-肝炎作用靶點之間的相互對應(yīng)關(guān)系。將活性成分和肝炎靶點作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，兩者之間的相互作用作為網(wǎng)絡(luò)中的連接，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中構(gòu)建舒肝寧注射液“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。并應(yīng)用內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度、介度、及緊密度等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（String）是一種包含已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫, 其中收集了大量的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。將舒肝寧注射液與肝炎相關(guān)的靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白間的相互作用關(guān)系，將結(jié)果保存成TSV 格式，保留文件中節(jié)點1、節(jié)點2 和結(jié)合得分信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行分析，保存結(jié)果。使用Cytoscape 3.8.2 軟件設(shè)置節(jié)點大小和顏色反映度(Degree)值的大小，邊的粗細用于反映結(jié)合得分的大小，獲得舒肝寧注射液作用靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因功能和信號通路分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）為基因和蛋白提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，可以對差異基因進行功能和通路富集分析。將舒肝寧注射液作用與肝炎相關(guān)的蛋白靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，選擇標識符為標準的基因名稱，列表類型設(shè)置為基因列表，限定物種為人，對舒肝寧注射液作用靶點進行KEGG 通路分析，閾值設(shè)置為P<0.01 保存結(jié)果，并按照涉及的靶點數(shù)目多少進行排序，篩選排名靠前的信號通路，采用GraphPad Prism 5.0 軟件繪圖。GO 富集分析是指在某一功能層次上統(tǒng)計蛋白或者基因的數(shù)目組成的一個有向無環(huán)圖，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）3 個分支。使用Cytoscape 3.8.2 軟件中的插件對舒肝寧注射液中活性成分作用靶點進行GO 分析，閾值設(shè)置為P<0.05，篩選靠前的條目，采用GraphPad Prism 5.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 舒肝寧注射液中活性成分的篩選

通過搜索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP，從茵陳、梔子、黃芩、板藍根和靈芝中分別收集到53、98、87、169、242 個主要的化學(xué)成分。對收集到的化學(xué)成分，以生物利用度>30%、藥物相似性>0.18 以及相關(guān)文獻參考作為篩選標準，獲得30 個活性成分，黃芩10 個、梔子8 個、板藍根7 個、茵陳3 個、靈芝2 個。黃芩含有刺槐黃素、黃芩素、β-谷甾醇、黃連堿、千層紙素A、谷甾醇、黃芩黃酮I、豆甾醇、角鯊烯、漢黃芩素；梔子含有異歐前胡素、β-谷甾醇、藏紅花酸、歐前胡素、山奈酚、槲皮素、豆甾醇、角鯊烯；板藍根含有刺槐黃素、β-谷甾醇、半齒澤蘭素、高車前素、甜橙黃酮、谷甾醇、豆甾醇；茵陳含有谷甾醇、芫花素和槲皮素；靈芝含有β-谷甾醇、過氧麥角甾醇。刪除重復(fù)活性成分后，共得到活性成分20 個。

2.2 潛在靶點的預(yù)測及篩選

通過STITCH 軟件進行分析，預(yù)測舒肝寧注射液中20 個活性成分的靶點，預(yù)測得到87 個蛋白靶點。再通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中與肝炎有關(guān)的基因進行比對，取交集得到83 個與肝炎相關(guān)的靶點。其中肝炎相關(guān)性得分大于10 分并且經(jīng)文獻證實的基因有15 個，分別為：腫瘤蛋白P53（TP53）、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-6（IL-6）、載脂蛋白E（APOE ）、ATP結(jié)合盒亞家族B 成員11（ABCB11）、半胱氨酸蛋白酶-8（CASP8）、溶質(zhì)載體有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族成員1B1（SLCO1B1）、細胞色素 P450 2D6（CYP2D6）、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 1A7（UGT1A7）、細胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 1A3（UGT1A3）、細胞色素 P450 1A2（CYP1A2）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）。

2.3 舒肝寧注射液“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 構(gòu)建“活性成分-肝炎作用靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖1。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，度值排名靠前的活性成分有 ：刺槐黃素、谷甾醇、黃芩素、木蝴蝶素、漢黃芩素、槲皮素、山奈酚、角鯊烯，度值都為10。提示以上活性成分為舒肝寧注射液抗肝炎的主要活性成分。度值排名靠前的肝炎靶點有：CYP1B1、CYP1A2、CYP1A1、CASP3，度值分別為8、5、5、4；EGFA、NR1I2、ICAM1、PARP1 、CYP2D6、CYP3A4，度值都為2。圖中可以看到刺槐黃素、甜橙黃酮、黃芩素、芫花素、異歐前胡素可共同作用于靶點CYP1A2；β-谷甾醇、谷甾醇、黃芩黃酮 I 可共同作用于靶點CASP3；刺槐黃素、高車前素、可同時作用于靶點VEGFA，漢黃芩素、槲皮素可共同作用于MCL1，而豆甾醇可同時作用于ABCA1、ABCG8、ABCG5、SLCO1B1、TNF、IL-8、IL-10。同一靶點可對應(yīng)不同的活性成分，不同靶點也可以對應(yīng)相同的活性成分，充分體現(xiàn)了舒肝寧注射液多成分、多靶點的作用特點。

圖1 舒肝寧注射液的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將蛋白靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)詳見圖2。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示度值排名靠前的靶點有：TNF、TP53、IL-6、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、MAPK3、CXCL8、IL-10，度值分別為33、32、31、23、23、23、22、22、20、19。度值大的靶點提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，度值大的靶點很可能是舒肝寧注射液治療肝炎的關(guān)鍵靶點。

圖2 舒肝寧注射液靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 基因功能分析

GO 富集分析的結(jié)果詳見圖3～圖5。其中BP(圖3)分析中排名靠前的生物過程依次為細胞過程、生物過程的調(diào)控、對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對應(yīng)激的反應(yīng)、細胞代謝過程調(diào)控、生物質(zhì)量調(diào)控、基礎(chǔ)代謝過程調(diào)控、大分子代謝過程的調(diào)控、細胞對刺激的反應(yīng)、信號處理。CC 分析（圖4）中排名靠前的細胞組分依次為細胞質(zhì)、膜結(jié)合細胞器、細胞質(zhì)部分、細胞器部分、細胞內(nèi)細胞器部分、不溶性組分、細胞器腔、膜封閉腔、細胞器膜、細胞內(nèi)細胞器腔。 MF 分析（圖5）中排名靠前的分子功能依次為蛋白結(jié)合、催化活性、過度金屬離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、受體結(jié)合、腺苷酸結(jié)合、嘌呤核苷結(jié)合、核苷結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合。

圖3 舒肝寧注射液主要活性成分潛在作用靶點GO 富集分析的生物過程結(jié)果

圖4 舒肝寧注射液主要活性成分潛在作用靶點GO 富集分析的細胞組分結(jié)果

圖5 舒肝寧注射液主要活性成分潛在作用靶點GO 富集分析的分子功能結(jié)果

2.6 信號通路分析

KEGG 通路分析結(jié)果如圖6 所示，排名靠前的是TNF (15 個靶點) 、IL-17（14 個靶點）、MAPK（14 個靶點）等信號通路。

圖6 舒肝寧注射液主要活性成分潛在作用靶點KEGG 富集分析的通路結(jié)果

3 討論

舒肝寧注射液是茵陳、梔子、黃芩、板藍根和靈芝等五味中藥材的提取物組合而成的一種純中藥注射劑，在臨床上被廣泛用于治療急慢性病毒性肝炎、藥物性肝炎、膽汁淤積性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭等肝臟疾病。研究發(fā)現(xiàn)舒肝寧注射液對于肝炎患者治療效果顯著，且不良反應(yīng)較少，安全有效性高[4]，但其抗肝炎保肝的作用機制尚不清楚。

本研究中，通過檢索TCMSP 獲得舒肝寧注射液中的活性成分，根據(jù)ADME 值對活性成分進行篩選，繪制“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)分析獲得度值排名靠前的活性成分，作為可能為舒肝寧注射中發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分，結(jié)果顯示其主要有刺槐黃素、谷甾醇、黃芩素、木蝴蝶素、漢黃芩素、槲皮素、山奈酚、角鯊烯。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩中的黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A 可以分別作用NF-κB 信號通路的不同階段發(fā)揮抗炎作用[5]；梔子中的異歐前胡素，可以通過下調(diào)肝纖維化指標，抑制炎癥因子的釋放，改善肝纖維化的進程[6]；山奈酚具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[7]并且可以通過抑制CHOP 分子改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細胞損傷[8]；槲皮素能通過調(diào)控PI3K/AKT/NF-κB 信號通路來改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織脂肪變性程度,減輕肝臟炎癥[9]；板藍根中的豆甾醇能明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA 和蛋白水平的提高，抑制前列腺素E2 和一氧化氮的釋放從而實現(xiàn)其抗炎作用[10]；茵陳中的芫花素具一定的清除自由基、抗炎、抑制腫瘤的作用[11]。舒肝寧注射液可能通過以上活性成分發(fā)揮其抗肝炎保肝作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，舒肝寧注射液活性成分作用于83 個肝炎靶點，成分靶點網(wǎng)絡(luò)顯示了舒肝寧注射液多成分、多靶點的抗炎保肝作用特點（圖1）。蛋白作用網(wǎng)絡(luò)顯示了舒肝寧注射液靶蛋白間存在著相互關(guān)系（圖2）。靶點的GO 分析結(jié)果表明，舒肝寧注射液抗炎保肝作用涉及細胞、生物過程的調(diào)控、對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對應(yīng)激的反應(yīng)等過程的調(diào)控，涉及細胞質(zhì)、膜結(jié)合細胞器、細胞內(nèi)細胞器等細胞組分，以及蛋白結(jié)合、催化活性、過度金屬離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能，是一個復(fù)雜的過程（圖3～圖5）。靶點KEGG 通路分析結(jié)果顯示，舒肝寧注射液抗炎保肝的的靶點主要涉及TNF、IL-17、MAPK 等信號通路（圖6）。

舒肝寧注射液作用的肝炎靶點中， PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果中度值排名前十、肝炎相關(guān)性得分大于10 分并且有文獻證實的基因共有8 個分別為：CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、IL-10、IL-6、TNF、TP53、VEGFA，提示以上靶點可能為舒肝寧注射液抗肝炎的主要靶點。TP53 是一個抑癌基因，編碼的蛋白質(zhì)對各種細胞應(yīng)激作出反應(yīng)，以調(diào)節(jié)靶基因的表達，從而誘導(dǎo)細胞周期停滯、凋亡、衰老、DNA 修復(fù)或代謝變化。TP53 突變與乙型肝炎相關(guān)的肝細胞癌密切相關(guān)[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)TP53 突變與肝細胞癌的免疫微環(huán)境失調(diào)有關(guān)，會導(dǎo)致肝細胞癌免疫應(yīng)答下調(diào)[13]。IL-10 編碼的蛋白質(zhì)是一種細胞因子，主要由單核細胞產(chǎn)生，少部分由淋巴細胞產(chǎn)生。該細胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中具有多效作用，被認為在乙型肝炎病毒感染的免疫學(xué)中起重要作用[14]。IL-6 編碼的細胞因子在炎癥和B 細胞成熟中起作用。該蛋白質(zhì)主要在急性和慢性炎癥的部位產(chǎn)生，在那里它被分泌到血清中，并通過IL-6 受體α 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄炎癥反應(yīng)，其中包括經(jīng)典的NF-κB 信號通路，通過控制一系列生長因子和細胞因子的表達在肝臟炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[15]。CYP1A2、CYP3A4和CYP2D6 基因編碼的蛋白質(zhì)屬于細胞色素P450超家族酶的成員，可催化藥物代謝、合成膽固醇、類固醇和其他脂類的許多反應(yīng)。這類蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可代謝多達25%的常用處方藥。有研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性肝炎患者中，CYP2D6 可作為LKM-1 的主要靶自身抗原，在肝細胞質(zhì)膜上異常表達，引發(fā)自身免疫性反應(yīng)[16]。CYP1A2 則被發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性在吸煙者和 HBsAg 血清陰性個體中是與肝細胞癌易感性相關(guān)的[17]。VEGFA 是PDGF/VEGF 生長因子家族的成員，它編碼一種肝素結(jié)合蛋白，以二硫鍵連接的同源二聚體形式存在。丙型肝炎病毒感染的主要并發(fā)癥是誘發(fā)肝纖維化。有文獻報道VEGFA 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平與丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化進展之間相關(guān)，并且丙型肝炎病毒患者的VEGFA 在mRNA 和蛋白質(zhì)的表達明顯高于對照組，而且晚期肝纖維化階段的患者表現(xiàn)出最高的VEGFA mRNA 和蛋白質(zhì)水平[18]。舒肝寧注射液的活性成分可能通過對以上靶點相互作用，實現(xiàn)其抗肝炎保肝的作用機制。

舒肝寧注射液篩選得到的肝炎靶點所富集的通路中，腫瘤壞死因子（TNF）通路參與多種生物過程的調(diào)節(jié)，包括細胞增殖、分化、凋亡、脂質(zhì)代謝和凝血過程。研究顯示TNF 通路相關(guān)基因的變異與乙型肝炎病毒的清除有關(guān)[19]，TNF-α/JNK 信號通路也與孟魯司特改善刀豆素A 誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎的作用相關(guān)[20]。IL-17 介導(dǎo)的信號通路與自身免疫性肝病的治療相關(guān)，通過影響組織微環(huán)境可促進肝臟炎癥和自身免疫[21]。女性失代償性急性乙型肝炎患者中，IFN-γ 和IL-4 下調(diào)的伴有增強的肝IL-17 陽性細胞增多可以加速破壞性免疫，以增強病毒清除。靶向涉及IL-17 的通路的治療可預(yù)防肝移植或失代償性急性乙型肝炎患者的死亡[22]。MAPK8、MAPK3 編碼的蛋白質(zhì)是 MAP 激酶家族的成員，MAP 激酶，也稱為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，在信號級聯(lián)反應(yīng)中起作用，該級聯(lián)調(diào)節(jié)響應(yīng)各種細胞外信號的各種細胞過程，例如增殖、分化和細胞周期進程。有文獻研究了宿主遺傳因素在乙肝疫苗抗乙型肝炎病毒感染長期免疫中的作用，發(fā)現(xiàn)MAPK8 的變異影響了宿主anti-HBs 的峰值水平[23]。并且有研究發(fā)現(xiàn)micro RNA-155 通過MAPK 信號通路，通過靶向SOCS1，調(diào)節(jié)酒精性肝炎大鼠的肝星狀細胞的增殖、凋亡和細胞周期進展[24]。舒肝寧注射液活性成分可能作用于以上靶點及信號通路實現(xiàn)其抗炎保肝作用。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示舒肝寧注射液的20 種活性成分作用于83 個蛋白靶點，其中刺槐黃素、谷甾醇、黃芩素、木蝴蝶素、漢黃芩素、槲皮素、山奈酚、角鯊烯為舒肝寧注射液治療肝炎的主要活性成分，CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、IL-10、IL-6、TNF、TP53、VEGFA 為舒肝寧注射液治療肝炎的主要靶點，舒肝寧注射液可能通過以上活性成分和蛋白靶點相互作用，實現(xiàn)其抗肝癌作用，并通過TNF、IL-17、MAPK 等信號通路改善肝炎患者癥狀。本研究表明舒肝寧注射液作用機制涉及多種過程、分子和通路，體現(xiàn)了舒肝寧注射液多成分-多靶點-多途徑的作用特點。本研究為舒肝寧注射液抗炎保肝作用分子機制的進一步研究提供了思路和方法。