在體單向灌流法研究阿哌沙班腎衰大鼠腸吸收特性

張 歡，汪 麗，張 優(yōu)，謝 沛，李 娜，丁家榮，王 雷 （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：a. 腎臟病科, b. 消化內(nèi)科, 上海 00433; . 上海大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 上海 00444）

臨床流行病學(xué)顯示，終末期腎臟病患者發(fā)生房顫的風(fēng)險(xiǎn)是一般人群的10 倍[1]。口服抗凝劑是預(yù)防房顫血栓形成的重要治療方法，但現(xiàn)有口服抗凝劑缺乏針對(duì)終末期腎臟病患者的臨床研究，其安全性和有效性并不確切[2-3]。阿哌沙班是一種新型口服Xa 因子的抑制劑，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療血栓形成。研究顯示，阿哌沙班可降低腎病合并房顫患者的大出血、血栓栓塞和死亡風(fēng)險(xiǎn)，為此類患者提供新的抗凝藥物選擇[3]。但阿哌沙班缺少在終末期腎臟病患者（血肌酐清除率<15 ml/min）中使用的臨床資料，且目前阿哌沙班腸道吸收部位尚不明確，其吸收的影響因素也不清楚，因而，一定程度上限制了其應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬通過探究阿哌沙班在腎衰大鼠腸道內(nèi)的吸收部位、吸收機(jī)制以及P 糖蛋白抑制劑對(duì)其腸道吸收的影響，以便為阿哌沙班在終末期腎臟病患者中使用提供一定的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-2030 Plus 高效液相色譜儀、AUW120D電子天平（日本島津公司）；UVF 超純水器（上海和泰儀器有限公司）；超聲清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；Hei-Tec 磁力攪拌器（德國海道爾夫）；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

阿哌沙班原料藥（武漢嘉葉生物科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（南京化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、二水合鹽酸二氫鈉、氯化鎂、氯化鈣、葡萄糖、乙酸銨（上海國藥集團(tuán)）；甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；純凈水（杭州娃哈哈股份有限公司）?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 雄性大鼠，230～250 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，環(huán)境溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度60%，光照時(shí)間8:00—18:00。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)溶液配制

2.1.1 Kreb-Ringer's 營養(yǎng)液（K-R 氏液）

精確稱取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgCl2·6H2O 0.02 g、NaH2P040.32 g、NaHCO31.37 g，用超純水溶解后加入0.37 g CaCl2至溶解完全，臨用前加入葡萄糖1.4 g，轉(zhuǎn)移至1 000 ml 容量瓶中定容至刻度，調(diào)節(jié)pH 至7.4。

2.1.2 阿哌沙班儲(chǔ)備液

精確稱取9 mg 阿哌沙班原料藥置于容量瓶中，加入3 % SDS，定容至100ml，作為阿哌沙班儲(chǔ)備液備用。

2.1.3 不同濃度的阿哌沙班腸循環(huán)液

分別取0.5、1.0、4.0ml 阿哌沙班儲(chǔ)備液至100 ml容量瓶中，加入K-R 營養(yǎng)液，超聲溶解后定容至100ml，配置成的阿哌沙班溶液濃度分別為0.45、0.90、3.60 μg/ml。

2.1.4 含P 糖蛋白抑制劑的阿哌沙班供試液

精確稱取0.5g 的鹽酸維拉帕米置于100 ml 容量瓶中，加入超純水溶解配制成濃度為5 mg/ml 的鹽酸維拉帕米儲(chǔ)備溶液。分別取1 ml 鹽酸維拉帕米儲(chǔ)備溶液和1 ml 阿哌沙班儲(chǔ)備溶液置100ml 容量瓶，配制成含鹽酸維拉帕米濃度為50 μg/ml、阿哌沙班濃度為0.9 μg/ml 的供試品溶液。

2.2 高效液相色譜檢測(cè)

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Gemini 5u C18110A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 相為 甲醇，B 相為10 mmol/L 醋酸胺溶液；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取空白K-R 溶液、阿哌沙班K-R 溶液以及阿哌沙班K-R 回流收集液，2000 r/min 離心5 min后取上清液10 μl，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析[4-5]。結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸灌流液中阿哌沙班峰形良好，保留時(shí)間約為7 min，空白K-R溶液及空白腸灌流液對(duì)其無干擾，專屬性良好。

圖1 阿哌沙班的HPLC 色譜圖

2.2.3 阿哌沙班的線性關(guān)系

精密量取阿哌沙班標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用K-R 溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，離心后取上清液，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。線性回歸分析結(jié)果表明阿哌沙班在0.36-4.5 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 阿哌沙班的回收率試驗(yàn)

精密量取阿哌沙班標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用K-R 溶液配制濃度呈0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供試品溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，離心后取上清液，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算阿哌沙班在低、中、高濃度溶液中的回收率。低、中、高濃度溶液中阿哌沙班平均回收率分別為97.39 %、98.91 %、99.92 %，RSD 分別為1.94 %、1.88 %、1.25 %，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 阿哌沙班的穩(wěn)定性考察

精密量取阿哌沙班標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用K-R 溶液配制濃度為0.45、0.9、3.6μg/ml 的阿哌沙班供試品溶液，置于37 ℃水浴3 h，考察藥物在K-R 液中的穩(wěn)定性。結(jié)果0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供試液的 RSD 分別為 0.51 %、1.65 %、0.50%，表明3 h內(nèi)阿哌沙班的穩(wěn)定性良好。

2.3 阿哌沙班大鼠腸吸收特性的研究

2.3.1 大鼠慢性腎功能衰竭模型建立

雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按劑量40 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉成功后，取仰臥位固定，常規(guī)消毒，沿左腹旁腎臟位置切開皮膚并逐層分離皮下組織進(jìn)入腹腔，暴露左側(cè)腎臟，切開上、下極的包膜，采用針形電燒灼器分別在左腎上、下極電凝腎臟表面，逐層縫合肌層和皮膚，關(guān)閉腹腔。2 周后，沿右腹旁腎臟位置處切口切開皮膚，逐層分離皮下組織進(jìn)入腹腔，暴露右側(cè)腎臟，用絲線結(jié)扎右腎腎門，切除右腎。

2.3.2 腎衰大鼠單向腸灌流模型的建立

取慢性腎功能衰竭大鼠，禁食12 h，期間自由飲水，按劑量40 mg/kg 腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉成功后，取仰臥位固定，常規(guī)消毒皮膚。沿腹中線取長(zhǎng)約3 cm 縱行手術(shù)切口，分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸處各取間距約為10 cm 兩個(gè)微小切口，分別在兩切口處置入無菌引流管，并用絲線固定。取預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，直至澄清液體，引流管連接恒流泵，以2.0 ml/min 的起始流速將濃度為0.9 μg/ml 的阿哌沙班溶液泵入腸段，待腸段內(nèi)藥液充滿后將流速降低至0.2 ml/min，此后按15 min/次的頻率收集腸回流液，計(jì)算腸回流液的質(zhì)量減少量及15 min 內(nèi)收集到的流出液體的質(zhì)量，并測(cè)定收集液中藥物濃度。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間2 h。樣品采集完后處死大鼠，剪下所研究的腸段，將其平鋪，測(cè)量其長(zhǎng)度以及橫截面半徑。

2.3.3 腸吸收參數(shù)的計(jì)算

采用質(zhì)量法對(duì)回流液流入和流出體積進(jìn)行校正。按下式計(jì)算吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀滲透系數(shù)（Papp）：

式中Vin和Vout分別為灌入和收集的回流液體積（ml），Cin、Cout分別為進(jìn)口和出口處回流液中藥物的質(zhì)量濃度（μg/ml），v為灌流速度（ml/min），r為被灌流腸段的橫截面半徑（cm），L為被灌流腸段的長(zhǎng)度（cm）。

2.3.4 阿哌沙班在慢性腎衰大鼠各腸段吸收情況測(cè)定

根據(jù)測(cè)定收集液中阿哌沙班濃度，計(jì)算不同腸段中阿哌沙班Ka和Papp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腸對(duì)阿哌沙班的吸收速率最快，結(jié)腸段最慢，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各腸段間的阿哌沙班表觀吸收系數(shù)未見明顯異常。如表1 所示。

表1 不同腸段藥物吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)(n=6)

2.3.5 阿哌沙班濃度對(duì)其吸收特性測(cè)定

配制濃度分別為0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”項(xiàng)下操作流程選取腎衰大鼠回腸進(jìn)行灌流，測(cè)定灌流液中阿哌沙班的濃度，計(jì)算藥物Ka和Papp。結(jié)果顯示，在回腸段，阿哌沙班藥物濃度越高，腸道對(duì)其吸收速率和表觀吸收系數(shù)越低（P<0.05），如表2 所示。

表2 回腸不同濃度藥物吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)(n=6)

2.3.6 P-gp 抑制劑對(duì)阿哌沙班吸收特性的影響

按“2.1.4”項(xiàng)下方法配制含鹽酸維拉帕米的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”項(xiàng)下操作流程選取大鼠空腸及回腸進(jìn)行灌流，測(cè)定灌流液中阿哌沙班的濃度，計(jì)算藥物Ka和Papp，研究P-gp 外排作用對(duì)阿哌沙班在空腸和回腸段的吸收特性影響。結(jié)果顯示，加入維拉帕米后，阿哌沙班的Ka和Papp的值均增加，提示阿哌沙班是 P-gp 的底物，P-gp 抑制劑顯著促進(jìn)阿哌沙班的腸吸收，如表3 所示。

表3 P-gp 抑制劑對(duì)阿哌沙班在空腸和回腸段吸收特性的影響(n=6)

3 討論

阿哌沙班是新型口服、高效、高選擇性的Xa因子抑制劑，自2013 年上市以來，隨著應(yīng)用的推廣，阿哌沙班適應(yīng)證由早期的關(guān)節(jié)置換術(shù)后預(yù)防靜脈血栓形成逐漸拓展為廣泛的預(yù)防和治療血栓的形成[6-10]。慢性腎臟病是臨床常見病和多發(fā)病[11]。研究顯示，相對(duì)于健康人群，終末期腎臟病患者發(fā)生房顫的風(fēng)險(xiǎn)增加10 倍，嚴(yán)重危及終末期腎臟病患者的生命安全[1]。房顫是臨床最常見的心律失常疾病，其極易誘發(fā)血栓形成，抗凝治療是房顫病人預(yù)防血栓形成及栓塞的必要治療手段[12]。但目前臨床上常見的口服抗凝劑均缺乏針對(duì)腎臟病患者的臨床研究，其安全性和有效性存疑[3,8,13]。在一項(xiàng)和華法林的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于華法林，阿哌沙班可降低終末期腎臟病合并房顫患者的大出血、血栓栓塞和死亡風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，腎功能損傷對(duì)阿哌沙班血漿濃度與抗FXa 活性的關(guān)系無明顯影響[14]。這也給這部分患者帶來了新抗凝劑的選擇。然而，對(duì)于其腸道主要吸收部位及吸收機(jī)制了解欠缺也在一定程度上限制了其臨床的應(yīng)用。

本研究通過比較腎衰大鼠不同腸段藥物濃度的測(cè)定來推測(cè)阿哌沙班在腸道內(nèi)的吸收部位及吸收機(jī)制，并通過給予P 糖蛋白抑制劑來研究其對(duì)腸道吸收阿哌沙班的影響。目前研究胃腸道對(duì)藥物吸收情況的方法主要分為在體實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)三種[15]。其中在體實(shí)驗(yàn)又分為兩種：循環(huán)灌流法和單向灌流法[15-17]。單向灌流法具有通用性好、耗時(shí)少及流速低的特點(diǎn)，同時(shí)顯著減少了對(duì)腸道生理環(huán)境的影響，最終實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性高[16,18]。在本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的阿哌沙班因其溶解性低、滲透性差及難以被吸收的限制，導(dǎo)致腸道對(duì)酚紅吸收增加，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)算校正影響大，故選用單向腸灌流法進(jìn)行試驗(yàn)以及重量法進(jìn)行校正計(jì)算[19]。

有文獻(xiàn)報(bào)道[20]，當(dāng)藥物的Papp小于 0.03×10?4cm/s時(shí)表明該藥物吸收較差；Papp大于0.2×10?4cm/s 時(shí)表明該藥物吸收完全；而介于兩者之間則為中等吸收。阿哌沙班在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Papp值均保持約0.2×10?4cm/s，說明阿哌沙班在各腸段均有良好吸收行為。此外，高血壓是慢性腎衰患者最常見的并發(fā)癥，常需使用多種降壓藥物聯(lián)合治療，P-gp 抑制劑維拉帕米作為經(jīng)典的鈣通道拮抗劑廣泛應(yīng)用于臨床降壓治療。既往研究顯示，阿哌沙班和利伐沙班可被細(xì)胞色素P450 3A 和P-gp 所消除[21]。為進(jìn)一步明確P-gp 對(duì)阿哌沙班的吸收影響，本研究觀察了P-gp 抑制劑鹽酸維拉帕米對(duì)阿哌沙班腸道吸收的影響，結(jié)果表明加入P-gp 抑制劑后，阿哌沙班在空腸和回腸段Ka和Papp值均有不同程度的增加，推測(cè)阿哌沙班是P-gp 的底物， P-gp抑制劑的加入有利于增加阿哌沙班的吸收程度，從而提高阿哌沙班口服生物利用度。不同濃度的阿哌沙班溶液在回腸的吸收情況不同，低濃度與高濃度之間存在顯著性差異，且高濃度的Ka及Papp的值最小，表明阿哌沙班的吸收存在自身濃度抑制，其吸收機(jī)制應(yīng)為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上所述，阿哌沙班在各腸段均有吸收；P-gp抑制劑對(duì)阿哌沙班在空腸和回腸段的吸收均有明顯的促進(jìn)作用，表明阿哌沙班為P-gp 底物，推測(cè)其吸收機(jī)制為主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。本文擬通過探究阿哌沙班在腸道內(nèi)的吸收部位、吸收機(jī)制以及P 糖蛋白抑制劑對(duì)其腸道吸收的影響，為今后阿哌沙班的使用提供一定的參考依據(jù)。