基于16S rDNA 測(cè)序研究新西蘭兔腹腔鏡探查術(shù)后腹腔微生物群落多態(tài)性改變

張平平，吳文斌，曹 奇，曲 卓，王 培 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)教研室, 上海 00433；. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川750000）

隨著腹腔鏡技術(shù)在普外科、婦科、泌尿外科等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，在一些外科疾病如膽囊結(jié)石，闌尾炎，子宮肌瘤的治療上，腹腔鏡手術(shù)正在逐漸取代傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)。較傳統(tǒng)手術(shù)而言，腹腔鏡手術(shù)具有較高診斷準(zhǔn)確率和治療能力[1]，且具有手術(shù)出血量少、腸蠕動(dòng)恢復(fù)早、術(shù)后疼痛輕、術(shù)后恢復(fù)快、下床活動(dòng)時(shí)間早、住院時(shí)間短、手術(shù)口美觀、術(shù)后并發(fā)癥降低等優(yōu)勢(shì)[1-2]。然而，無(wú)論是傳統(tǒng)手術(shù)和腹腔鏡手術(shù)，術(shù)后感染依然是影響患者預(yù)后的重要并發(fā)癥。對(duì)于腹腔鏡手術(shù)如何直接改變腹腔微生物群落種類(lèi)及數(shù)量，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

通過(guò)DNA 測(cè)序?qū)ξ⑸锓N群進(jìn)行鑒定（菌種鑒定）是比傳統(tǒng)生化鑒定更為先進(jìn)、更為準(zhǔn)確的鑒定方法。16S rDNA 是編碼原核生物（主要為細(xì)菌）核糖體小亞基rRNA（16S rDNA）的DNA 序列，長(zhǎng)度約為1 540～bp，存在于所有細(xì)菌染色體基因組中。16S rDNA 分子大小適中，突變率小，目前是細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)研究中最常用的基準(zhǔn)序列。16S rDNA 測(cè)序不依賴菌種本身的性質(zhì)，使得它對(duì)所有菌種均可使用。通過(guò)對(duì)16S rDNA 的測(cè)序，可以快速、直觀地明確細(xì)菌群落多樣性的變化。

本研究通過(guò)制作新西蘭兔腹腔鏡探查術(shù)模型，對(duì)術(shù)后動(dòng)物腹腔積液進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序，對(duì)比分析腹腔積液中的微生物多態(tài)性，探索腹腔鏡術(shù)后的微生物變化情況，可為腹腔鏡手術(shù)的術(shù)后感染提供有效防治依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

雄性2 月齡新西蘭兔6 只（上海甲干生物科技有限公司），體重約為2 kg，分別設(shè)置模型組（n= 3）和對(duì)照組（n= 3）。

1.2 儀器

ABI GeneAmp? 9 700 型PCR 儀；NanoDrop2000型分光光度計(jì)；CQZ2000720 型便攜一體式電子腹腔鏡，腹腔鏡鏡頭型號(hào)為J1000B 型、J1030B 型（上海卓外醫(yī)療電子科技有限公司）；手提式高壓蒸汽滅菌器DSX-24L-I（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.3 藥物與器材

2%戊巴比妥鈉溶液（0.4 g 戊巴比妥鈉粉末溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液）；碘伏溶液；液氮；0.9%氯化鈉注射液；手術(shù)器械（打孔器、手術(shù)刀、組織剪、血管鉗、鑷子、布巾鉗、圓針三角針、手術(shù)單）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)將6 只新西蘭兔分成兩組，分別設(shè)置模型組（n= 3）和對(duì)照組（n= 3），模型組麻醉后給予腹腔鏡探查術(shù)，術(shù)后關(guān)閉腹腔；對(duì)照組麻醉后開(kāi)腹，然后關(guān)閉腹腔。

2.2 制作模型

對(duì)模型組新西蘭兔稱(chēng)重，耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（劑量1 ml/kg），麻醉成功后（呼吸平穩(wěn)，角膜反射消失，身體肌肉松軟），脫毛備皮，固定，生理鹽水清洗皮膚，碘伏溶液消毒皮膚3 次（范圍為傷口周?chē)?5 cm）。鋪手術(shù)巾，鋪巾鉗固定。沿腹正中線上切開(kāi)皮膚，向下分離肌肉筋膜，切開(kāi)腹膜，腹腔鏡打孔器深入腹腔，插入腹腔鏡套筒。將腹腔鏡沿腹膜伸進(jìn)去，到達(dá)肝臟表面，探查肝臟及膽囊約2 min。取出腹腔鏡及套筒，消毒手術(shù)區(qū)域，關(guān)閉腹腔，縫合手術(shù)切口，敷料固定。對(duì)對(duì)照組進(jìn)行相同操作，但不進(jìn)行腹腔鏡探查術(shù)。待新西蘭兔麻醉蘇醒后，送回動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)。

2.3 組織取材

腹腔鏡術(shù)后模型制備一周后，動(dòng)物取材。新西蘭兔稱(chēng)重，備皮，分別對(duì)模型組動(dòng)物和對(duì)照組動(dòng)物固定、消毒、鋪巾，沿腹正中線行5 cm 切口，打開(kāi)腹膜腔，用無(wú)菌注射器深入到腹腔后部最低處，吸取約1.5 ml 腹腔液體，放入相應(yīng)編號(hào)的EP 管中（并備份），液氮冷藏，隨后進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序。

2.4 細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序

根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit （美國(guó)Omega Bio-tek公司）進(jìn)行腹腔液體微生物群落的DNA 抽提，使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rDNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。在Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。使用Fastp 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash 軟件進(jìn)行拼接后，在美吉生物的I-Sanger平臺(tái)上進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 模型組相比于對(duì)照組微生物群落種類(lèi)增加

以最小二乘法對(duì)樣本做判別分析（PLS-DA），尋找物種豐度矩陣和樣品分布/分組信息的最大協(xié)方差，在門(mén)水平和種水平上，模型組樣本與對(duì)照組樣本組內(nèi)聚合良好、組間區(qū)分明顯（圖1A、圖1B）。結(jié)果顯示為兩組樣本細(xì)菌的種類(lèi)均一度良好。對(duì)兩組樣本數(shù)據(jù)做Venn 圖分析，顯示兩者共有的OTU數(shù)目為957，模型組OTU 數(shù)目為2 206，對(duì)照組OTU 數(shù)目為592。模型組腹水OTU 含量高于對(duì)照組，表明模型組細(xì)菌種類(lèi)較對(duì)照組明顯升高（圖1C）。

圖1 模型組與對(duì)照組樣本聚合度與OTU 含量

3.2 新西蘭兔腹腔鏡手術(shù)后細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)量均增加

對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行α 多樣性分析，菌落豐富度Sobs 及Ace 值越高提示微生物群落豐度越高，結(jié)果顯示模型組比對(duì)照組微生物群落豐度更高（圖2A、圖2B）。在微生物群落多樣性分析中，Shannon 指數(shù)提示，數(shù)值越高多樣性越大；Simpson指數(shù)提示，數(shù)據(jù)越小多樣性越大。得出模型組在微生物群落豐度和多樣性方面均高于對(duì)照組（圖2C、圖2D）。從Alpha 多樣性指數(shù)表中可得出同樣的結(jié)論（表1）。

圖2 兩組樣本微生物種類(lèi)及數(shù)量變化情況

表1 Alpha 多樣性指數(shù)表

通過(guò)對(duì)樣本的OTU 分類(lèi)學(xué)分析，對(duì)樣本測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等進(jìn)行聚類(lèi)，通過(guò)對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，在豐度-均勻度曲線中，水平方向是物種豐度，曲線在橫軸上的寬度越大，提示豐度越高。曲線的形狀反映了物種的均勻度，曲線越平緩，物種越豐富。模型組相對(duì)于對(duì)照組曲線寬度更寬，更平緩。提示模型組細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量以及含量高于對(duì)照組（圖2E）。

3.3 模型組的雜菌數(shù)量及其他菌群高于對(duì)照組

對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行微生物組成成分分析，在對(duì)照組中其他菌群數(shù)量占整體菌群數(shù)量的35.08%（圖3A），而模型組其他菌群數(shù)量占整體菌群數(shù)量的65.04%（圖3B），說(shuō)明經(jīng)過(guò)腹腔鏡手術(shù)后，不明原因的其他菌群數(shù)量升高。模型組較對(duì)照組菌群占比升高的菌群有出血敗血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、正皮氏羅爾斯頓菌等。由此得出結(jié)論：腹腔鏡手術(shù)后雜菌的數(shù)量顯著增加，且以出血敗血性巴斯德菌、草酸桿菌科、普雷沃菌、瘤胃球菌、 正皮氏羅爾斯頓菌等升高為主。

圖3 微生物菌群組成成分比較

3.4 新西蘭兔腹腔鏡手術(shù)后巴斯德菌明顯增加。

微生物組在目、科、屬、種水平上進(jìn)行物種差異性分析。在目水平上，得出以下微生物群落升高：巴斯德菌目、馬賽菌目、沙壤土桿菌目、莫拉菌目、奈瑟菌目、山羊海藻百伯史坦菌目、冢村氏菌目； 在科水平上，發(fā)現(xiàn)以下微生物群落升高：巴斯德菌科、奈瑟菌科、紫杉霉菌科、熱苜蓿菌科、冢村氏菌科、膜桿菌科、虎蛆科、Akk 菌科 、韋榮氏球菌科；在屬水平上，發(fā)現(xiàn)以下微生物群落升高：巴斯德菌屬、馬賽菌屬、莫拉菌屬、奈瑟菌屬、山羊海藻百伯史坦菌屬、冢村氏菌屬；在種水平上，發(fā)現(xiàn)以下微生物群落升高： 巴斯德菌、類(lèi)芽孢桿菌、奈瑟菌、拉姆利桿菌、馬賽菌、赤蘚科菌、冢村氏菌、馬賽菌、鏈球菌屬。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)在目、科、屬、種上模型組均有增長(zhǎng)且增長(zhǎng)較為明顯的菌種為巴斯德菌（圖4A～圖4D)。

圖4 模型組高于對(duì)照組微生物群落的情況

4 討論

隨著腹腔鏡手術(shù)大量應(yīng)用于臨床，相比于傳統(tǒng)手術(shù)而言，術(shù)后感染雖有所下降[3]，但由于植入材料的應(yīng)用，腹腔術(shù)后感染發(fā)生率依然很高。有研究表明，在腹腔鏡術(shù)后患者的術(shù)后感染中革蘭陰性菌占半數(shù)以上，以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜血菌屬為主；革蘭陽(yáng)性菌以溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌為主；真菌以念球菌屬、光滑假絲酵母菌、白假絲酵母菌為主[3-5]。在這些術(shù)后感染的病人中，感染的部位主要集中在肺部、腹部和尿道[5]，從而引起相應(yīng)術(shù)后并發(fā)癥。

本研究通過(guò)對(duì)新西蘭兔進(jìn)行腹腔鏡探查手術(shù)，發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組在樣本菌群的聚合度良好，并且在模型組中，菌群的多樣性和豐度比對(duì)照組高。在進(jìn)行兩組樣本微生物群落對(duì)比分析中發(fā)現(xiàn)，在屬水平上模型組的其他菌群占比由35%上升至65%。表明菌群群落數(shù)量在腹腔鏡手術(shù)術(shù)后顯著升高，且以草酸桿菌科、有益桿菌、巴斯德菌、瘤胃球菌、黃桿菌升高為主，其中巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏羅爾斯頓菌、黃桿菌導(dǎo)致人感染疾病。研究發(fā)現(xiàn)，巴斯德菌是一種來(lái)源于動(dòng)物的革蘭陰性球菌，可引起蜂窩織炎、腹膜炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和化膿性關(guān)節(jié)炎等疾病[6]，嚴(yán)重者病死率可達(dá)到31%[7]。瘤胃球菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌，是人類(lèi)正常腸道菌群的一員[8]，可以導(dǎo)致炎癥性腸病[9]。正皮氏羅爾斯頓菌是革蘭陰性桿菌，容易侵襲免疫功能低下的患者，可導(dǎo)致嚴(yán)重的菌血癥和腎盂腎炎[10]。有研究表明，在195 名呼吸功能衰竭患者中有黃桿菌定植，但均未出現(xiàn)相應(yīng)的并發(fā)癥。微生物菌群物種差異性分析發(fā)現(xiàn)，在科、目、種、屬水平上，模型組較對(duì)照組在巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌、熱苜蓿菌、葉綠體、噬纖維菌等均有不同程度上升，而其中巴斯德菌、奈瑟菌、冢村氏菌可導(dǎo)致人類(lèi)發(fā)病。據(jù)相關(guān)研究顯示。冢村氏菌是一種革蘭陽(yáng)性、專(zhuān)性需氧、弱抗酸細(xì)菌，可導(dǎo)致人體肺部感染[11]。奈瑟菌可導(dǎo)致人體感染尿道炎、腦膜炎[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)巴斯德菌、瘤胃球菌、正皮氏羅爾斯頓菌、黃桿菌、奈瑟菌、冢村氏菌在模型組呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，這些菌種可引起腹腔、尿道、肺部感染，出現(xiàn)嚴(yán)重的腹膜炎、腸梗阻，尿道炎以及腦膜炎，甚至導(dǎo)致病人死亡，對(duì)腹腔鏡腹腔感染控制有一定的指導(dǎo)意義。由于本次為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可能存在手術(shù)室條件有限，手術(shù)者操作不規(guī)范等將細(xì)菌帶入腹腔情況，能否在臨床病人身上得出同樣的結(jié)論，還需要做進(jìn)一步的研究。