HPLC 法同時測定陳香露白露片中7 個成分的含量

張 璐，戴群芳，陳思思 （江西省南昌市檢驗檢測中心, 江西 南昌 330000）

陳香露白露片的處方由陳皮、甘草、川木香、大黃、石菖蒲五味中藥和碳酸鎂、氧化鎂、次硝酸鉍、碳酸氫鈉4 種化學(xué)藥組成[1]。方中陳皮行脾胃之氣[2,3]，為君藥，主要活性成分為橙皮苷、川陳皮素、橘皮素，與甘草配伍，健脾祛濕[4]；甘草苷、甘草酸銨為甘草的主要活性成分；川木香具行氣止痛之效[5]，廣泛用于腹痛，食欲不振等，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯為其主要活性成分。加之碳酸氫鈉等堿性藥物中和胃酸[6]，共成健胃和中、理氣止痛功效。

陳香露白露片目前執(zhí)行的質(zhì)量標準為《衛(wèi)生部藥品標準WS3-B-1 553-93》，該標準僅設(shè)置了化學(xué)藥成分的質(zhì)量控制參數(shù)，難以全面反映產(chǎn)品質(zhì)量，存在較大的安全風(fēng)險。為實現(xiàn)陳香露白露片內(nèi)在質(zhì)量的有效控制，本實驗構(gòu)建了同步測定陳香露白露片中甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等7 種特征活性成分含量的HPLC 方法。該研究不僅為提高該制劑質(zhì)量提供了有效、可靠的分析方法，同時對藥品安全風(fēng)險評估的有效實施也具有重要的研究意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司），配置DAD 檢測器；XS105DU 電子天平、ME 204E 電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品甘草苷（批號：111610-201908，含量95.0%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，含量96.2%）、橙皮苷（批號：110721-202019，含量95.3%）、川陳皮素（批號：112055-202001，含量99.6%）、橘皮素（批號：112054-202001，含量99.8%）、木香烴內(nèi)酯（批號：111524-201911，含量99.9%）、去氫木香內(nèi)酯（批號：111525-201912，含量99.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛公司）；其余試劑均為分析純（購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為娃哈哈純凈水。16 批陳香露白露片樣品來自3 個生產(chǎn)廠家：廣西圣特藥業(yè)有限公司（企業(yè)1），批號201207（S1）、190202（S2）、200506（S3）、210106（S4）、210107（S5）、210110（S6）、201102（S7）；貴州百靈企業(yè)集團制藥有限責(zé)任公司（企業(yè)2），批號20191211（S8）、20210105（S9）、20210111（S10）、20201212（S11）、20201001（S12）；四川康福來藥業(yè)集團（企業(yè)3），批號200902（S13）、200901（S14）、201202（S15）、200601（S16），以上樣品規(guī)格均為每片重0.3 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為甲醇，流動相B 為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～8 min，15% A；8～35 min，15% A→50% A；35～50 min，50% A；50～65 min，50% A→80% A；65～66 min，80% A→15% A；66～75 min，15% A），流速1.0 ml/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μl，檢測波長237 nm（0～15 min，檢測甘草苷）、283 nm（15～25 min，檢測橙皮苷）、237 nm（25～34 min，檢測甘草酸銨）、330 nm（34～45 min，檢測川陳皮素、橘皮素）、237 nm（45～75 min，檢測去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液

取甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，用50%甲醇配制成濃度分別為55.72、1 108、307.2、56.25、18.75、26.01、58.95 μg/ml 的混合對照溶液。

2.2.2 供試品溶液

取陳香露白露片樣品，研細，精密稱取約1 g，置于錐形瓶中，精密加入25 ml 50%甲醇，超聲30 min（功率250 W，頻率33 kHz），放冷，精密稱定，用50%甲醇補充損失的重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液

分別按陳香露白露片處方中各藥比例制備缺陳皮、甘草、川木香的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成缺陳皮、甘草、川木香的陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

對照品溶液、供試品溶液及缺陳皮、甘草、川木香的陰性供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進行測定分析。結(jié)果如圖1 所示，甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等7 種成分與相鄰峰分離良好，分離度均大于1.5；陰性樣品中其他成分色譜峰均未對7 種成分產(chǎn)生干擾，表明該分析方法專屬性良好。

圖1 陳香露白露片HPLC 色譜圖

2.4 線性范圍考察

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 ml 置于5 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀釋，制備6 個濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，并繪制標準曲線，其中橫坐標為對照品的濃度（X，μg/ml），縱坐標為峰面積（Y）。7 種成分線性范圍、線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果顯示，7 種成分分別在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 7 種成分的線性范圍、線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)測定6 次。結(jié)果顯示甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積6 次測定結(jié)果的RSD 分別為0.37%、0.38%、0.39%、0.42%、0.48%、0.75%、0.67%，表明該儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

按“2.2.2”項下方法平行制備6 份陳香露白露片（批號：20210105）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果顯示甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量依次分別為1.158、4.002、10.68、0.063 3、0.147 7、0.132 3、0.292 7 mg/g，其RSD 分別為0.62%、0.65%、0.64%、1.05%、1.62%、0.87%、1.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號：20210105），放置 0、4、8、12、16、20、24 h 后，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果顯示甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD 依次分別為0.54%、0.68%、0.72%、1.02%、0.85%、1.60%、1.32%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的陳香露白露片（批號：20210111）9 份，每份約0.5 g，精密稱定，基于樣品中7 種成分的含量分別按低、中、高3 種濃度水平加入對照品溶液（每個濃度各3 份），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果顯示7 種成分的回收率分別為98.71%、98.12%、98.44%、98.22%、99.17%、99.18%、97.93%，RSD 分別為0.16%、0.67%、0.57%、0.62%、0.48%、0.56%、0.58%，表明該方法準確性高。

2.9 樣品含量測定

取16 批陳香露白露片樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并在“2.1”項下色譜條件測定樣品。外標法計算16 批次樣品中7 種成分的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示16 批樣品中甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量分別為0.125 0～1.174、2.354～7.426、1.822～27.21、0.037 0～1.399、0.072 3～0.443 3、0.014 0～0.199 0、0.220 7～1.407 mg/g。

表2 16 批樣品中7 種成分含量測定結(jié)果(mg/g，n=2)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實驗色譜條件參考《中華人民共和國藥典》（2020 年版）一部，237 nm 為甘草苷、甘草酸銨的檢測波長[7]，225 nm 為木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的檢測波長[7]，對兩個檢測波長均進行了待測成分響應(yīng)值及專屬性的考察，結(jié)果顯示各成分在237 nm 波長處響應(yīng)值均較高且與雜質(zhì)峰分離良好，故最終選擇237 nm 作為甘草苷、甘草酸銨、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等4 種成分的檢測波長。而橙皮苷、川陳皮素、橘皮素均參考藥典上的檢測波長[7]。陳香露白露片中所含成分復(fù)雜，等度洗脫很難將7 個化學(xué)成分同時分離，故采用梯度洗脫。

3.2 聚類分析

利用SPSS 軟件以16 批陳香露白露片中7 種有效成分含量作為變量進行聚類分析。結(jié)果如圖2所示，16 批樣品以度量值11 為閾值，聚分為2 大類，其中一大類主要為企業(yè)2 和3 的樣品，另一大類主要為企業(yè)1 的樣品。結(jié)果表明由于企業(yè)缺少對該品種中重要指標成分的含量控制，導(dǎo)致產(chǎn)品在不同企業(yè)，以及相同企業(yè)不同批次之間質(zhì)量差異較大。

圖2 16 批樣品測定結(jié)果聚類分析圖

3.3 含量分析

由表2 得知，16 批陳香露白露片7 種主要成分含量差異較大。其中，橙皮苷含量差異主要表現(xiàn)在不同生產(chǎn)企業(yè)之間，主要原因可能是各生產(chǎn)企業(yè)使用了不同產(chǎn)地、不同采收期、不同生長年限的原藥材導(dǎo)致的差異。而去氫木香內(nèi)酯含量差異主要表現(xiàn)在同一生產(chǎn)企業(yè)的不同批次之間，其原因可能是藥材養(yǎng)護措施不當(dāng)、生產(chǎn)工藝控制參數(shù)不合理導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分去氫木香內(nèi)酯損失產(chǎn)生的差異?；谏鲜鲅芯浚ㄗh生產(chǎn)企業(yè)加強對陳皮、甘草、川木香等原藥材中關(guān)鍵活性成分的質(zhì)量控制，建立高于《中華人民共和國藥典》的內(nèi)控標準，嚴格按批準的處方和生產(chǎn)工藝進行投料與生產(chǎn)，進一步提高陳香露白露片的質(zhì)量一致性，從而實現(xiàn)其療效的穩(wěn)定性和有效性。