肝蘇顆粒質(zhì)量標準提升研究

陶朝陽，史鵬杰，周 鑫，孫連娜 （. 西藏軍區(qū)總醫(yī)院藥物制劑研究中心, 西藏 拉薩 850007；. 上海中醫(yī)藥大學中藥學院, 上海 003）

肝蘇顆粒是由苗藥趕黃草（Penthorum chinensePursh）加工制成的單方制劑，1998 年被列為基本藥物，在臨床上主要用于治療酒精性肝損傷、慢性乙型肝炎等疾病[1],目前收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十三冊》（下稱《部頒標準》）[2]。近年來對肝蘇顆粒的研究主要集中于藥理與臨床研究，藥理研究表明肝蘇顆粒對CCl4致化學性、膽管阻塞性和免疫性大鼠肝纖維化模型均有治療作用，可明顯抑制肝臟脂質(zhì)過氧化損傷，改善肝功能和減輕肝臟纖維化[2-4]；臨床上，明確了采用肝蘇顆粒聯(lián)合西藥共同作用，在治療慢性乙型肝炎、保肝降酶、退黃上均具有高于單用西藥的治療效果[5-8]，但對其制劑質(zhì)量控制的研究較少，鑒于《部頒標準》發(fā)布時間久遠，隨著研究進展及分析技術(shù)與設備的進步，應制定更為科學、完善的標準，以保證制劑穩(wěn)定、臨床用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1 260 高效液相色譜儀、DAD 紫外檢測器、Chemstation 色譜工作站（美國Agilent 公司）；XS105DU 電子天平、XS104 電子天平（梅特勒公司）；HSW-24 四孔水浴鍋、SY-360H 超聲儀（上海誠獻儀器設備有限公司）；DHG-9053A 鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DL-I-15 臺式封閉電爐（天津恒瑞科教儀器有限公司）；ATS 4 全自動點樣儀（瑞士CAMAG 公司）。

1.2 藥品與試劑

喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷為本課題組分離純化而得，采用高效液相色譜法以峰面積歸一化法測定其純度均大于98%；15 批含糖型肝蘇顆粒均由四川古藺肝蘇藥業(yè)有限公司提供，（批號：190401、190402、190403、190404、190405、190406、190407、190408、190409、190410、190411、190412、190111、190119、190123，分別編號為GSKL1～GSKL15，規(guī)格：9g/袋）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為杭州娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

取肝蘇顆粒適量，研細（過3 號篩），取1.0 g，精密稱定，精密加入10 ml 80%甲醇，稱定重量，超聲提取15 min（功率350 W，頻率53 kHz），取出放至室溫，用80%甲醇補足失重，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷標準品適量，精密稱定，置于容量瓶，加入80%甲醇定容至刻度線，制成每1 ml 含喬松苷1 mg 的標準品溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液5 μl、對照品溶液2 μl，分別點于同一高效硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，熱風吹至斑點顯色清晰，置紫外光（365 nm）下檢視。根據(jù)圖1 顯示，供試品色譜與對照品色譜中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在相同位置顯示相同顏色斑點。

圖1 肝蘇顆粒TLC 色譜圖

2.2 喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，28%→30% A；10～17.5 min，30%→ 34.5% A；17.5～20 min，34.5%→90% A；檢測波長：280 nm（紫外檢測時間20 min）；柱溫：30 ℃；流速：1.0ml/min；進樣量：10 μl。

2.2.2 對照品溶液的配制

取喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.24 mg/ml的對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取肝蘇顆粒適量，研細（過3 號篩），取粉末1.0 g，精密稱定，置100 ml 具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 80%甲醇溶液，稱定重量，超聲處理15 min，取出放至室溫，用80%甲醇補足失重，搖勻，取樣過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 專屬性考察

取提取溶劑80%甲醇與對照品儲備液、樣品溶液，按上述色譜條件進樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。根據(jù)結(jié)果，喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷分離效果良好，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于7 700。

圖2 肝蘇顆粒中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的 HPLC 色圖譜

2.2.5 線性關(guān)系考察

量取對照品儲備液（240μg/ml）適量，依次用80%甲醇稀釋成240、120、60、24、4.8、2.4μg/ml，以進樣質(zhì)量為橫坐標 (X) ，峰面積為縱坐標 (Y) 進行回歸，得喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的標準曲線為：Y=2 323.574 8X+2.053 7，r= 0.999 9，表明喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在2.4～240 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液（240μg/ml）10μl，在上述液相色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測定峰面積，結(jié)果顯示喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面積RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗

取肝蘇顆粒(GSKL-10)，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6 份，測定峰面積，結(jié)果顯示喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰的平均峰面積為1 789.29，RSD 為2.12%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗

取肝蘇顆粒（GSKL-10），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h 進樣，結(jié)果顯示喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面積為1 788.29，RSD 為0.67%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

分別稱取肝蘇顆粒（GSKL-10）6 份已知含量的樣品約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照接近 1∶1 的量計算所需添加的喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液，加入到樣品中，按“2.2.3”項下方法平行制成6 份供試品溶液，進樣 10 μl，記錄峰面積，結(jié)果顯示喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率為100.76%，RSD 為 0.66%，說明該方法準確度較好，計算結(jié)果見表1。

表1 喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.2.10 樣品含量測定

分別取每批肝蘇顆粒適量，研細（過3 號篩），取粉末1.0 g，精密稱定，按“2.2.3”項下的方法制成供試品溶液，每批樣品平行制備2 份，每份進樣3 次，進樣量10 μl，記錄峰面積，計算喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 15 批肝蘇顆粒中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定結(jié)果( x±SD)

3 討論

3.1 薄層色譜條件優(yōu)化

肝蘇顆粒目前沒有被中國藥典收錄，僅收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部部頒標準中藥成方制劑十三冊》附錄中，其中將槲皮素作為薄層鑒別項下的主要成分，但是槲皮素的含量較低，且專屬性較差。按照部頒標準的方法制備供試品溶液，方法較為繁瑣且樣品濃稠不易展開。本研究結(jié)合前期關(guān)于肝蘇顆粒活性成分的報道[9-12]，選擇了喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷為特征成分進行薄層鑒別。在本實驗中，綜合考察了供試品的點樣體積（2 μl、5 μl）對薄層展開的影響，發(fā)現(xiàn)樣品點樣量5 μl、對照品點樣量2 μl 并點成條帶狀，視檢結(jié)果最佳。為了進一步考察薄層鑒別的適用性，本研究還對實驗室溫度（4 ℃、22 ℃）、濕度（30%、70%）以及不同品牌硅膠板（MachereyNagel 牌、黃海牌、銀龍牌）進行了考察，發(fā)現(xiàn)本實驗建立的肝蘇顆粒薄層鑒別方法耐用性較好，可以更好的實現(xiàn)肝蘇顆粒質(zhì)量標準提升。

3.2 含量測定成分的選擇

文獻研究發(fā)現(xiàn)，喬松素-7-O-β-D-葡萄糖在肝蘇顆粒中的含量較高，且具有較高的專屬性，因此，在本研究中將其作為肝蘇顆粒的含量測定的指標性成分。同時，在確定含量測定成分的基礎上，為了充分獲得肝蘇顆粒中的喬松素-7-O-β-D-葡萄糖的含量，本研究對供試品溶液的提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（水、不同體積分數(shù)的甲醇）、提取料液比（1∶25、1∶50、1∶100）及提取時間（0.25、0.5、0.75 h）等進行了考察，最終確定采用80%甲醇（1∶25）超聲提取0.25 h 作為肝蘇顆粒供試品溶液的制備方法。

3.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化

本研究采用二極管陣列檢測器對待測成分進行了全波長光譜掃描，結(jié)果顯示，待測成分在280 nm波長處均有較強吸收，基線較平穩(wěn)，分離度較好，且測定不受雜質(zhì)的干擾，故最終選擇280 nm 作為檢測波長。本研究考察了2 種流動相體系（乙腈-水、甲醇-水）對色譜峰峰形的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)喬松素-7-O-β-D-葡萄糖的分離度，但是出現(xiàn)了較為嚴重的拖尾現(xiàn)象。通過對喬松素-7-O-β-D-葡萄糖結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，其中含有較多的酚羥基，因此在水相中添加酸（0.5%甲酸）會大大改善喬松素-7-O-β-D-葡萄糖拖尾的現(xiàn)象，故選擇乙腈-0.5%甲酸溶液作為流動相。當然，在本研究中還對肝蘇顆粒中喬松素-7-O-β-D-葡萄糖的含量測定的耐用性進行了考察，通過外標一點法分別對不同儀器不同色譜柱[Atlantis?T3 (4.6 mm×250 mm，5μm)、DikmaDiamonsilC18(4.6 mm×250 mm，5μm)]、不同柱溫（20、25、30 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2ml/min）進行考察，發(fā)現(xiàn)均能夠滿足喬松素-7-Oβ-D-葡萄糖的含量測定，說明本研究建立的喬松素-7-O-β-D-葡萄糖含量測定方法具有很強的普適性。

綜上，本文建立的肝蘇顆粒薄層鑒別及喬松素-7-O-β-D-葡萄糖含量測定的方法，解決了現(xiàn)行標準中供試品制備繁瑣、指標性成分含量低且專屬性差的難點，具有精密度高、重復性好和穩(wěn)定有效的特點。綜合考慮測定結(jié)果及肝蘇顆粒制備過程中該成分的轉(zhuǎn)移率，擬定本品每袋含喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷（C21H22O9）計，不得少于12.0 mg，可用于肝蘇顆粒藥品質(zhì)量的控制。